Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définitions et bilan Qu’est-ce que la génomique structurale? Qu’est-ce que la.

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1 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définitions et bilan Qu’est-ce que la génomique structurale? Qu’est-ce que la génomique fonctionnelle (post-génomique) ? Bilan de l’avancée en génomique et post-génomique Applications de la génomique à l’amélioration des plantes Le marquage moléculaire (voir) La transgénèse (voir TD) Conclusion

2 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes La génomique est la science qui étudie le matériel héréditaire des êtres vivants La génomique structurale. Elle consiste à décrire l’organisation du génome, à dresser l’inventaire des gènes et à en faire le séquençage La génomique fonctionnelle. Elle consiste à étudier la fonction des gènes

3 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes GENOMIQUE STRUCTURALE SEQUENCAGE GENOME NUCLEAIRE ADNc - EST CARTOGRAPHIE GENETIQUE PHYSIQUE Cours UMBGV101 F. Varoquaux Cours UMBGV101 E. Lacombe

4 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie génétique L1 L2 F1 F2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ……………………… X RI Parents si possible génétiquement très différents Découverte de polymorphisme facile (morphologiques – marqueurs moléculaires) Population immortelle – multiplication par autofécondation AUTOFECONDATION / HAPLODIPLOIDISATION Analyse de la liaison génétique entre les différents marqueurs. Distance : CENTIMORGAN LOGICIEL MAPMAKER

5 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie génétique 12345678910101 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020 21212 2323 2424 m1m1 CCLLLLCLCLCCLLLLLCLCLLCC m2m2 CCCCLLCCCLCCLCLLLLLLLCCC m3m3 CCLLLLCLCLCLLLLLLCLCLLCL ORDRE m1 m3 : 2 m1 m2 : 7 m2 m3 : 9 m1m1 CCLLLLCLCLCCLLLLLCLCLLCC Ordre probable celui qui s’explique par le moins d’événements de recombinaison m2 m1 m3 8,3 CM29 CM 37.5 CM

6 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie génétique Lui YG et al., 1996 De très nombreuses cartes génétiques ont été produites chez A.thaliana. Parents différents. Types de marqueurs différents. Exemple d’une carte obtenue sur les RILs Col x Ler – 129 marqueurs RFLP

7 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie physique Ordonner des fragments d’ADN Digestion partielle Clonage dans des vecteurs permettant le clonage de fragments de grande taille (YAC, BAC: Yeast Artificial Chromosome, Bacterial Artificial Chromosome) Mesure de la taille moyen des inserts : but - cloner plusieurs équivalents génome pour maximiser ses chances d’avoir cloner l’ensemble du génome (exception faite centromères et télomères) Conservation de la banque en plaques microtests

8 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie physique Criblage de la banque par hybridation moléculaire ou par PCR Exemple de la banque YAC CIC (Creusot et al.1996) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 COLONNES PLAQUE 1 PLAQUE 2 PLAQUE 3 PLAQUE 4 PLAQUE 12 A B C D E F G H LIGNES EXTRACTION D’ADN Réalisation de pools dans les 3 dimensions Pools colonne Pools ligne Pools plaque Exemple 1 : pool plaque 1 comprend tous les ADN compris sur la plaque 1 Exemple 2 : pool colonne 1 comprend tous Les ADN de la colonne 1 des lignes A-H Pour les plaques 1 -12.

9 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie physique Criblage de la banque par hybridation moléculaire ou par PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 COLONNES PLAQUE 1 PLAQUE 2 PLAQUE 3 PLAQUE 4 PLAQUE 12 A B C D E F G H LIGNES CRIBLAGE PCR PCR sur les pools 12 pools colonnes 8 pools lignes 12 pools plaques 32 PCR pour cribler 1152 plantes Exemple PCR pool lignes : pool G PCR pool colonnes : pool 10 PCR pool plaque : pool 1 clone positif : CIC 1G10 Vérification par PCR sur clone individuel

10 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Cartographie physique TROU Taille des inserts Nom des clones Place sur les cartes génétiques PCR, hybridation, extrémité de BAC

11 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Séquençage d’EST (Expressed Sequence Tag) Delseny et al. 1997 Extraction d’ARN à partir d’un tissu organe Génération d’ADNc Clonage des ADNc Séquençage des extrémités Analyse par BLAST et FASTA Entre 1991 -1997 une séquence produite pour environ 10000 gènes différents. Gènes fortement exprimés Possibilité d’utiliser des mélanges de tissus Séquençage d’une seule extrémité Voie choisie par les équipes américaines

12 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Séquençage du génome nucléaire

13 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes GENOMIQUE STRUCTURALE SEQUENCAGE GENOME NUCLEAIRE ADNc - EST CARTOGRAPHIE GENETIQUEPHYSIQUE Faire un catalogue rapidement des gènes exprimés Avoir une idée des gènes exprimés dans un tissu Idée des familles multigéniques Puce, SNP Accès aux séquences non codantes. Avoir une idée du ratio gène / Séquence non codante au niveau d’un locus. Etude des microsynthénies si séquençage du même locus sur différentes espèces. Elaboration / amélioration des logiciels de recherche de gènes (GENEFINDER) Mise en évidence des zones de haute recombinaison Ancrage des YAC (correction du risque de chimérisme) Repérage des carto génétiques aberrantes (hybridation) EST = source de marqueurs pour la cartographie. Répartition des gènes impliqués dans la même fonction en cluster ? Etude de la macrosynténie entre espèce Indice des duplications dans le génome Etude de la macrosynténie entre espèce Indice des duplications dans le génome Carte P pré requis séquençage génomique Carto – possibilité que l’on ne séquence pas un clone chimérique

14 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Séquençage d’EST PAP YAP Séquençage génomique Locus Em1 chromosome 3 Cartographie physique Etude du génome d’Arabidopsis thaliana Cartographie génétique Microsynténie avec le colza Beaucoup de gènes appartiennent à des familles 106 protéines ribosomiques 50 familles. 5 thiorédoxines h Beaucoup de gènes codent des protéines inconnues 3% des gènes ont des homologues avec plus de 80% d’ identité chez le riz Duplication du génome d’Arabidopsis Base de la cartographie comparée EUDICOT map (intermédiaire de clonage)

15 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Génome d’Arabidopsis thaliana (Wambutt et al., 2000) Taille : 130 MB Séquences répétées : 10% Nombre de gènes : 25 000 Organisation en cluster : 10 à 20% des gènes Taille moyenne de l’espacement entre deux gènes : 4.5 kb

16 Etude de la variabilité naturelle (limitée) Etude de l’expression des gènes (spatial, temporel,conditions,…) Niveau de l’ARN: DNA chips, microarrays Niveau protéine gel 2D,chromatographie,… (corrélations, problèmes avec les gènes faiblement exprimés ou dans des petits tissus). Recherche des partenaires (2-hybride, TAP TAG, CoIP,…) Recherche des modifications post-traductionnelles (Bioinformatique, biochimie,…) Recherche des localisations sub-cellulaires (bio-informatique, transgénèse Prom::pepsign::GFP,…) FONCTION ? Génétique inverse Knock-out = preuve directe La mutagenèse par insertion chez les plantes pour faire de la génétique inverse Où tu vis ? Qui sont tes amis ? Si tu disparais j’verrais c’que ça faisais Quels sont tes signes distinctifs?

17 Génétique inverse Mutagenèse d’insertion Recombinaison homologue Surexpression d’un gène Expression ectopique Transformation p35S::gène Inactivation d’un gène Stratégie antisens RNAi (RNA mediated interférence) Génétique inverse = fait partie des techniques de génomique fonctionnelle. Elle consiste à créer des mutants de gènes dont la séquence nucléotidique est connue Mutagenèse chimique Sature bien le génome mais par toujours facile de revenir au gène (TILLING) La mutagenèse par insertion chez les plantes pour faire de la génétique inverse

18 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Evaluation de la diversité génétique Evaluation de la diversité génétique, choix des lignées pour la création d’hybride

19 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Synténie entre les génomes Lr21 du blé tendre grace à un blé dioploïde Echec gènes de nodulation, Rfo (présence de marqueurs mais absence du gène

20 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Trouver un marqueur lié à un gène déterminant un caractère intéressant

21 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Trouver un marqueur lié à un gène déterminant un caractère intéressant

22 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Définition et bilan Placer des QTL sur une carte génétique Prérequis : Avoir une bonne carte génétique Idéal mais pas obligatoire : avoir des parents présentant une variation pour le caractère étudié Avoir une population immortelle Faire un bon phénotypage Exemple : trouver des QTL pour l’efficacité de l’utilisation de l’azote (Loudet et al., 2003) 20% de la variation est due à la génétique et potentiellement aux QTL

23 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes PHENOTYPAGE Variabilité dans chacuns des caractères étudiés Influence des parents

24 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes PHENOTYPAGE : regarder la corrélation entre les critères étudiés Exemple corrélation positive (+0.53 entre la teneur matière sèche lorsque les plantes sont cultivées sur des milieux riches (10mM) ou pauvres (3mM) en azote

25 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes DM 10 : 8 QTL DM3 : 4 QTL = 20% de la variation (héritabilité) Pourcentage du caractère expliqué par le QTL

26 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Que faire avec des QTL ou des gènes d’intérêt marqués ? suivre dans la sélection en utilisant les marqueurs liés Cloner le gène (co-localisation)

27 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Arabidopsis Découverte de la foction des 25000 gènes d’A.thaliana pour l’instant 5% (1330 fonction de gènes) Riz Séquencage di génome 16 banque d’ADNc 400 Est par banque Etude de la diversité génétique entre 4 variétés de riz. Création d’une banque de mutants d’ins’ertion 20000 lignées. Séquence de FST. Développement d’outil Puce catma (Complete Arabidopsis thaliana Micro Array) Accès à une collection de mutant étiqueté d’Arabidopsis. Bac fish

28 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Vigne Découverte dans le germplasm et Cartographie de gènes impliqués dans la résistance au mildiou et à l’oïdium Melon Clonage du gène VAT de résistance au puceron (plusieurs- un des premier) Piment Identification et clonage du gène PVR2 de résistance au virus Y (gène récessif – facteur de la plante nécessaire aux virus) Blé Clonage des gènes intervenant dans l’assimilation de l’azote (tolérance au manque d’azote Révélation de QTL de résistance à la fusariose et à la septoriose Développement de 4500 marqueurs microtellite Production de 110000 EST Mise au point d’une méthode de cartographie sur lignées de délétion Création d’une banque BAC génotype RENAN

29 Rôle de la génomique et de la post- génomique en amélioration des plantes Maïs 100000 EST Cartographie de 400 gènes d’intérêt Génétique reverse clonage de 10 gènes d’intérêt agronomique. Colza 38000 EST correspondant à 14000 gènes : réalisation d’une puce partielle. Création de banque BAC (colza et radis) pour le clonage de gènes de la qualité de l’huile. Clonage du gène Rfo; en cours cléistogamie et résistance au sclérotinia. Des SNP ont été réalisés à partir de séquence de gènes d’intérêt provenant d e mutants d’Arabidopsis grains ridés. Cartographie et clonage de nombreux gènes de résistance aux maladies. Tournesol Banque BAC 150000 clones 16000 EST (phase de croissance et développement) Recherhce de QTL productivité et résistance aux maladies Pois Création d’un bonne carte génétique Cartographie de gènes de qualité de la graine ou d’initiation florale Identification de 16 nouveaux gènes par homologie avec Arabidopsis (croissance déterminée et floraison tardive.