Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Cours de Biochimie des animaux domestiques Professeur: Fabrice Bureau Travaux pratiques 2 ème BAC:

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1 Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Cours de Biochimie des animaux domestiques Professeur: Fabrice Bureau Travaux pratiques 2 ème BAC: nouvelle version 2013-2014 Assistant: Julien Pujol

2 Faculté de Médecine Vétérinaire Travaux pratiques de biochimie 2 ème BAC Assistant: Julien Pujol Table des matières 1 ère semaine de TP TP-1: Introduction à la biochimie clinique et dosage des protéines sériques TP-2: Electrophorèse des protéines sériques et expérience énigme 2 ème semaine de TP TP-3: Mesure de l’activité enzymatique: dosage de la lactate déshydrogénase TP-4: Dosage du glucose dans le sérum

3 ORGANISATION DES TP Présence aux TP obligatoire Absence injustifiée, retards répétés, inattention, manque de politesse, tablier oublié  cote moyenne TP+TD < 12= non exempté de l’examen de TP-TD en fin d’année. Tabliers de laboratoire obligatoires Se munir de papier millimétré Sauf instructions contraires, chaque étudiant doit effectuer les protocoles complètement et posséder à la fin du TP les résultats de celui-ci A la fin de chaque TP, la paillasse et le matériel doivent être rangés et nettoyés. Quelles sont les règles?

4 Que fait-on en biochimie clinique ? Des examens de base: Marqueurs de fonction et état clinique d’organes tels reins, foie, muscles, système cardiovasculaire. Marqueurs de l’état inflammatoire, formule sanguine, gaz sanguins, analyses d’urines. Des examens plus spécialisés: - dosages hormonaux - marqueurs de cancer - recherche d’Ac spécifiques - étude de voies métaboliques - médicaments - … Faisant intervenir des techniques diverses (spectrophotométrie, immunologie, chromatographie, électrophorèse, …) INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE Biologie clinique PathologieMicrobiologieHématologiebiochimie clinique

5 Biochimie clinique: utilité et qualité des résultats? Les résultats de biochimie clinique complètent ceux des examens cliniques: la combinaison de tous ces résultats est indispensable pour évaluer correctement l’état physiologique de l’animal La qualité des résultats des analyses biochimiques dépend de la précision avec laquelle les manipulations en laboratoire sont effectuées mais également du soin avec lequel les prélèvements sont réalisés. INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

6 Sur le terrain: Récolte des prélèvements: Standardiser au maximum. Eviter de souiller les prélèvements avec de la poussière, des poils… Eviter de « traumatiser » le sang lors du prélèvement (évite l’hémolyse). Conservation des prélèvements: La conservation dépend du type d’analyse à effectuer. Dosages hématologiques: du sang complet (+anticoag.) - 6 h. à temp. Amb. - 4°C, frigo ou sur glace naturelle (12 – 20 heures) Dosages biochimiques: sur sérum ou plasma. - Freezer (plusieurs mois). INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

7 En laboratoire:3 notions essentielles -Le sérum= échantillon principal -Le matériel = Verrerie, micropipettes et spectrophotomètre -La courbe standard= outil nécessaire au traitement des mesures. INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

8 Analyses de Biochimie Le sérum Comment l’obtient-on? INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE (à compléter lors de la séance)

9 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE Afin de maintenir une constance dans les résultats et limiter les facteurs de variation, la verrerie utilisée dans les manipulations doit être chimiquement propre. Cela implique un nettoyage soigneux à l’eau savonneuse et des rinçages répétés à l’eau du robinet puis à l’eau distillée. La verrerie doit être parfaitement sèche avant utilisation. La verrerie:

10 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE Pipettes automatiques FRAGILES COUTEUSES Les micropipettes

11 Pipettes automatiques: Comment les utiliser ? Régler le volume désiré en faisant tourner la molette. Le trait de graduation doit être aligné avec la ligne de référence (voir démo en fonction des marques de pipettes). Ajuster un embout propre sur la pipette et contrôler l’étanchéité. Tips ou embouts INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

12 Pipettes automatiques: Comment les utiliser ? PHASE 1: Avant de plonger l’embout dans le liquide à prélever, appuyer sur le piston jusqu’à la première butée, cela correspond à la course étalonnée. PHASE 2: Immerger l’embout d’environ 5 mm et relâcher doucement le piston, le liquide monte ainsi dans l’embout. Soulever la pipette en glissant l’embout sur la paroi du récipient. INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

13 Pipettes automatiques: Comment les utiliser ? PHASE 3: Placer l’embout au fond du second récipient et presser doucement le piston jusqu’à la première butée, cela vide l’embout de son contenu. Enfoncer ensuite complètement le piston, ce qui chasse le reste de liquide de l’embout. Retirer la pipette en glissant l’embout sur la paroi du récipient; garder le bouton enfoncé jusqu’au bout de l’opération. Relâcher le bouton. Pour enlever l’embout usagé, presser le bouton-éjecteur. Utiliser un embout propre pour chaque liquide; changer l’embout en cas de rétention de gouttelettes INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE

14 Le spectrophotomètre: machine la plus utilisée pour les dosages Largeur = l Contient la solution d’échantillon à doser de concentration molaire c Valeur de l’absorbance A L’absorbance mesurée par le spectrophotomètre correspond à la diminution d’intensité lumineuse de la lumière monochromatique après traversée de la cuve de mesure Io = intensité lumineuse entrante I= intensité lumineuse sortante La loi de Beer Lambert lie l’absorbance d’une solution à la concentration molaire de son soluté absorbant: A= εlc c= concentration en mol/l l= largeur de la cuve en cm = 1 ε= coefficient d’extinction molaire en L.mol-1.cm-1 = constante pour un soluté donné

15 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE La courbe standard Pour un échantillon inconnu contenant un soluté X absorbant la lumière, de coefficient d’extinction molaire (ε) inconnu, on peut mesurer l’absorbance A. Par exemple A=1.3 ( pas d’unités). Mais on ne peut pas en déduire sa concentration (c inconnu) vu qu’ on ne connait pas (ε). Comment faire? Il suffit d’utiliser des échantillons standards contenant le même soluté mais à des concentrations connues (c standard) et de procéder à la mesure de l’absorbance de chaque échantillon standard. Exemple: -échantillon standard 1 de concentration connue 1 mol/L  A mesurée= 2 -échantillon standard 2 de concentration connue 0.4 mol/L  A mesurée=0.75 -échantillon standard 3 de concentration connue 0.1 mol/L  A mesurée= 0.24 Comment procèderiez-vous? Quelle était la concentration de l’échantillon inconnu?

16 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE La courbe standard On trace alors un graphique de A en fonction de c: Solution: C(mol/l)) A 0.5 1 1.5 2 0. 1 0.4 1 0 Pourquoi les points de ces standards ne sont-ils pas parfaitement alignés? Pourquoi devraient-ils l’être? Ech Standard 3 Ech Standard 2 Ech Standard 1

17 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE La courbe standard Parce qu’il y a toujours de petites erreurs dues à la manipulation, l’alignement parfait est juste théorique: les points devraient être théoriquement alignés car la relation qui lie l’absorbance à la concentration est linéaire (A= εlc =constante x c = l’équation d’une droite). Pour trouver la concentration de l’échantillon inconnu……à compléter….. Solution: C(mol/l)) A 0.5 1 1.5 2 0. 1 0.4 1 0 Ech Standard 3 Ech Standard 2 Ech Standard 1

18 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE La courbe standard Remarque: La courbe standard passe par 0 car on règle le spectrophotomètre en début de manipulation de telle manière qu’il associe une Absorbance nulle à un échantillon contenant une concentration nulle en soluté absorbant  cet échantillon est un « blanc ». C(mol/l)) A 0.5 1 1.5 2 0. 1 0.4 1 0 Ech Standard 3 Ech Standard 2 Ech Standard 1 Blanc tel que c = 0

19 INTRODUCTION A LA BIOCHIMIE CLINIQUE Elimination des déchets: Où ? Bidons pour déchets spéciaux: produits chimiques contaminants Poubelle à déchets biologiques

20 TP-1: dosage des protéines sériques

21 Rappel sur la structure des protéines TP-1: dosage des protéines sériques

22 Remarque: -Tryptophane et tyrosine absorbent naturellement à 280 nm (UV). Voir cours. -Mais proportion des ces 2 aa très variable  Mesure imprécise TP-1: dosage des protéines sériques Comment mesurer la masse de protéines présente dans un litre de sérum?: Nous avons vu hier que la méthode la plus courante de dosage des molécules du sérum était la spectrophotométrie, autrement dit la mesure de l’absorbance inhérente à ces molécules.. C’est le cas pour les protéines. Cependant, à l’état naturel dans le sérum, elles ne présentent pas d’absorbance propre utilisable pour doser de manière précise. Solution:  Utiliser la méthode colorimétrique du biuret par laquelle l’absorbance augmente de manière très précisément proportionnelle à la masse de protéines. Problématique:

23 Principe (historique): en milieu alcalin, 4 molécules de Biuret vont former un complexe de coordination avec l’ion Cu2+ et donner un composé de couleur violette. Molécule de Biuret Cu2+ Quel est le rapport avec les protéines? TP-1: dosage des protéines sériques Dosage par la méthode de Biuret (réalisée ici au TP)

24 TP-1: dosage des protéines sériques Ce que vous allez faire : Schéma global Sérum: échantillon inconnu ou standard Tube dans lequel vous avez ajouté 1ml de réactif de biuret Mélanger + 15 min d’incubation Mesurer l’absorbance et la reporter sur le graphique de l’absorbance en fonction de la concentration Verser dans la cuve de mesure 20 µl Réactifs disponibles: Nacl 0.9%Réactif de biuret Sérum standard Protéines= 64 g /l Sérum de concentration Inconnue en protéines

25 Première partie de la manipulation: réalisation des dilutions pour la courbe standard. On va faire des dilutions de 2 en 2 avec du NaCl 0,9% à partir de l’échantillon standard de départ. 64g/L 32g/L 16g/L 8g/L4g/L2 g/L NaCl 0,9% 35 µl TP-1: dosage des protéines sériques Détail: Ce que vous allez faire :

26 Deuxième partie de la manipulation: réalisation de la réaction de Biuret pour la courbe standard, le blanc et les échantillons inconnus. 64g/L 32g/L 16g/L 8g/L4 g/L 2 g/L NaCl seul 0 g/L Ech. incon. Inc.zéro 20µl 1 ml de réactif de biuret  15 minutes d’incubation TP-1: dosage des protéines sériques Ce que vous allez faire : Détail:

27 concentration absorbance 1 2 3 4 5 6 À partir des dilutions du standard Absorbance d’un échantillon inconnu Concentration de cet échantillon inconnu TP-1: dosage des protéines sériques Ce que vous allez faire : Troisième partie de la manipulation: Détail: Sur papier millimétré -Réaliser la courbe standard comme montré au TP précédent -Déduire la concentration en protéines des échantillons inconnus

28 Remarque: évaluation rapide de la protéinémie par réfractométrie: TP-1: dosage des protéines sériques

29 En pratique, pourquoi faire un dosage de protéines totales du sérum? Le taux de protéines totales peut informer sur la présence de diverses maladies métaboliques, infectieuses ou dégénératives et sur l’état nutritionnel de l’animal. Il peut être augmenté ou diminué par rapport à la norme. Pouvez-vous citer quelques exemples de cas où la quantité de protéines totales du sérum serait modifiée? Le dosage que nous avons réalisé est une mesure globale, comment pourrait-on mesurer spécifiquement les différents types de protéines du sérum?

30 TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

31 L’électrophorèse: une technique complémentaire à la spectrophotométrie Exemple: électrophorèse des protéines sériques L’électrophorèse des protéines totales du sérum permet de séparer celles-ci en 4 fractions protéiques = Albumine + α globulines + β globulines + γ globulines Elle peut donc permettre: - d’affiner un diagnostic d’hyper ou hypo-protéinémie - de confirmer un diagnostic pathologique suggéré par l’état clinique, même si les protéines totales sont dans la norme. TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

32 Qu’est-ce qu’une électrophorèse ? C’est une technique de biologie moléculaire qui permet de faire migrer et de séparer des particules chargées en solution grâce à l’influence d’un champ électrique. Les facteurs influençant la migration de ces molécules sont: -La charge nette de la molécule -La taille et la forme de la molécule -La force du courant électrique -Les propriétés du tampon -La température Effets fortement dépendants de la molécule  moteur de séparation TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

33 Le facteur de séparation le plus important est la charge de la protéine. Celle-ci dépend du pH du tampon de migration Rappel: Le tampon fixe le pH à une valeur donnée et contient des ions qui vont conduire le courant électrique.  Comment peut-on prédire la charge d’une protéine à un pH donné?  Vers quel pôle les protéines migreront –elles? Electrophorèse des protéines: TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

34 Charge des protéines: En solution aqueuse, la protéine possède des charges………. pH du tampon de migration= 8.6 Arginine pKr=12.5 Lysine pKr=10.5 Aa chargés……………….. à pH> pKaAa chargés………….. à pH< pKa ……….. à pH de l’électrophorèse ASP pKr=3.9 GLU pKr=4.3 Histidine pkr=6 Bilan TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

35 Electrophorèse des protéines sériques: Protocole: Pour cette technique, on utilise un gel d’agarose 1.Déposer 10 µl de sérum de chaque échantillon dans les puits du peigne. 2.Appliquer le peigne contre le gel et laisser pénétrer 40 secondes puis retirer le peigne. 3.Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse et appliquer une tension de 90 volts pendant 20 min. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -- + + Zone de dépôt des échantillons Migration pH=8.6 -- + + + - Gel d’agarose TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Densitomètre à 595 nm (ou scanner) 4 5 6 -- + + Electrophorèse des protéines sériques: Protocole: 4. Sécher 5. Colorer au bleu de coomassie 6. Retirer l’excès de coloration de l’agarose avec le tampon acide 7. Sécher et lire avec densitomètre TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

37 Quelques exemples d’électrophorèses normales α 1 α2 β γ1 β2β2β1β1α 1 α2 γ2γ2 γ TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

38 Quelques exemples d’électrophorèses anormales: TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

39 Remarque: diversité des anticorps et migration étalée des gammaglobulines: + diversité de la région variable (zone de liaison à l’antigène)  Pic polyclonal TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

40 Quelques exemples d’électrophorèses anormales: TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

41 Autres exemples d’électrophorèses anormales: Artefacts L’échantillon ne peut pas être hémolysé! Si tubes avec anticoagulants Fibrinogène de trouve dans la fraction β 2 Bovins (ß 1 ) Chiens (α 2 ) TP-2: électrophorèse des protéines sériques et expérience énigme

42 TP-2:expérience énigme Cette expérience est basée sur l’électrophorèse et les propriétés biochimiques des protéines. La majorité des principes nécessaires à la compréhension de l’expérience se trouve dans le cours et les TP/TD de biochimie.

43 S1 S1 S1 S1 S2 S3 S4 Echantillon de sérum 1 expérience énigme Echantillons de sérum 2,3,4 cas cliniques borne - borne + GEL agarose ETAPE 1: Charger les échantillons de sérum et faire l’électrophorèse à pH=8.6 Migration 20 min TP-2:expérience énigme

44 ETAPE 2: Préparer les tampons de coloration et décoloration TP-2: expérience énigme 20 ml 4 x Tubes 15 ml Notés « ‘ » A’ C’B’D’ BDC A 10 ml 4 x Tubes 50 ml ABCD ABCD 20 ml ABCD X? Composition (pour info): Tris-aminométhane: 40 mmol/L Acide borique: 100 mmol/L Acide acétique: 2.5% V/V Méthanol: 20 % V/V HCl : 72 mmol/L 30µl 1000µl1650µl2000µl 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml ABCD Bleu de coomassie 1% 1 ml ABCD Solution de départ = solution de décoloration 20 ml = solution de coloration 1 ml Solution inconnue X

45 ETAPE 3: Sécher le gel et le découper S1 S1 S1 S1 S2 S3 S4 Echantillons de sérum 2,3,4 cas cliniques Echantillon de sérum 1 expérience énigme TP-2: expérience énigme

46 ETAPE 4: Colorer les bandes d’échantillon S1 = plonger chaque bande dans un des 4 tubes A, B, C, D S1 S1 S1 S1 S2 S3 S4 Echantillon 1 expérience énigme Echantillons 2,3,4 cas cliniques ABCD 30 min (agitation) TP-2: expérience énigme

47 ETAPE 5: Décolorer (dans tubes A’, B’, C’, D’) et lire les bandes d’échantillon S1 ABCD 15 min (agitation) 10 ml A’B’ C’ D’ 10 ml A’B’ C’ D’ Transfert des bandes depuis les tubes de coloration vers les tubes de décoloration Retrait, séchage des bandes, visualisation et lecture au densitomètre TP-2: expérience énigme

48 But de l’expérience Répondre aux questions suivantes: 1.Quels sont les mécanismes biochimiques pouvant expliquer le résultat de l’expérience. 2. Que contient la solution inconnue X ? Vous me rendrez obligatoirement votre réponse par mail (1 réponse par groupe de TP à « julien.pujol@ulg.ac.be ») avant le lundi 3 mars 2014.

49 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la lactate déshydrogénase (LDH)

50 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH La spectrophotométrie nous avait permis de doser les protéines totales du sérum. Par contre, la plupart des protéines réagissant de la même manière aux méthodes colorimétriques il est souvent impossible de doser spécifiquement une seule protéine. Il y a cependant quelques exceptions et parmi elles : les enzymes. Pour doser une enzyme, on mesure la disparition du substrat spécifique de l’enzyme ou l’apparition du produit  on mesure donc l’action de l’enzyme ou son activité S + E ES E + P Mesure de la disparition Mesure de la formation ou Analyse par spectrophotométrie Comment dose –t-on les enzymes?

51 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Définition de l’activité: - L’activité s’exprime en Unités internationales par litre (UI/L) -1 UI = quantité d’enzyme capable de transformer 1 µmol de substrat en produit en 1 minute.  Notion de cinétique (vitesse): il suffit pour déterminer l’activité d’ajouter du substrat en excès et d’évaluer la quantité de produit apparue par minute εl[Produit]= A Temps (min) Le plus simple est de pouvoir mesurer l’absorbance quand le produit (ou le substrat) a une absorbance propre.

52 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH εl[Produit]= A Temps (min) Pour la précision de la mesure et par convention: On choisit de mesurer la variation d’absorbance au début de la réaction, là où la vitesse est quasi constante Vitesse constante Vitesse diminue La pente de cette droite donne l’augmentation de l’absorbance propre au produit par min c’est à dire l’augmentation de la concentration (puisque A= εl C = constante x C) en produit par min.  équivalent à l’activité que nous cherchons

53 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Que reste-il à faire? On a obtenu, par la mesure, la pente ou coefficient directeur de la droite : Pente =Δ A/min = Δεl[Produit]/min (car Beer Lambert : A=εl[Produit]) = Δ ε[Produit]/min (puisque l=1) = ε Δ [Produit]/min = ε Δ mol Produit/L/min (car [Produit] est en mol/L)

54 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Que reste-il à faire? Suite: Il faut coller à la définition de l’activité enzymatique c’est-à-dire l’ apparition de µmol de produit en 1 min c’est à dire: Activité (UI)= Δ µmol produit/min et donc Activité par litre (UI/L) = Δ µmol Produit/L/min Or on a mesuré: Pente= ε Δ mol Produit/L/min  10^6 x Pente = ε Δ µmol Produit/L/min Ou encore: 10^6 x Pente/ε = Δ µmol Produit/L/min On obtient: Activité/L= pente x 10^6/ ε UI/L Remplacer cette valeur en mole par une valeur en µmole revient à multiplier la valeur par 10^6 = Définition

55 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Application au dosage de la LDH La lactate déshydrogénase est une enzyme transformant le pyruvate en lactate ou le lactate en pyruvate, en fonction de leur concentrations relatives et de l’état oxydé ou réduit du coenzyme NAD. A chaque pyruvate converti en lactate, un NADH est transformé en NAD+ et inversement. Le NADH est la seule molécule absorbant à 340 nm. Sur la base de ce que nous venons de voir, comment pourriez-vous mesurer l’activité de la LDH d’un échantillon de sérum?

56 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH R1 lactate R2 NAD+ 800 µl  Sérum LDH 16µl  Mélanger et incuber 1 min  200 µl  Mélanger et incuber 2 min  Lire l’absorbance toutes les min pdt 10 min Protocole Cuve en quartz: nécessaire pour travailler en lumière UV Application au dosage de la LDH

57 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Application au dosage de la LDH Graphique et résultat -Réaliser un graphique de l’absorbance en fonction du temps (une mesure par minute pendant 10 min) comme vu en début de présentation. Remarque: la période des 10 premières min est caractérisée par une vitesse constante dans cette expérience. -Déterminer l’activité de la LDH dans un litre de votre échantillon de sérum Aide: le sérum a été dilué dans la cuve de mesure, tenez-en compte par rapport à la formule finale de l’activité par litre donnée plus haut dans le power point.

58 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Rôle de la LDH dans le métabolisme cellulaire: -Si la LDH fonctionne dans le sens lactate  pyruvate: Cycle de Krebs Mitochondrie Pyruvate ATP Lactate -Si la LDH fonctionne dans le sens pyruvate  lactate: Le lactate ne sert pas à la production d’énergie contrairement au pyruvate  Intérêt de transformer le pyruvate en lactate? Utilité évidente: ATP= énergie

59 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Rôle de la LDH dans le métabolisme cellulaire: En fait, la transformation du pyruvate en lactate par la LDH permet la régénération du cofacteur NAD+ nécessaire à la poursuite de la glycolyse. 2 lactates LDH 2 NAD+ glycolyse

60 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Intérêt en biochimie clinique du dosage de la LDH: Dosage de LDH totale: La LDH est une enzyme cytoplasmique. Sa présence dans le sérum indique qu’elle est sortie de la cellule, le plus souvent lors de destruction de celle-ci. Présente dans tous les tissus  difficile de déterminer l’origine de la lésion Dosage des ISO-LDH: Enzyme tétramérique: association de 4 sous-unités H (Heart) et/ou M (muscle) LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5 Cœur + Globules rouges Foie+ muscle squelettique Tissus lymphoïdes poumonsrein Majoritaire dans: 5 iso-enzymes

61 TP-3: mesure de l’activité enzymatique: dosage de la LDH Intérêt en biochimie clinique du dosage de la LDH: Comment peut-on doser séparément ces iso-enzymes? Auriez vous un exemple de maladie pouvant engendrer une augmentation de la LDH sérique?

62 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum

63 Il existe 2 grands types de méthodes de dosage du glucose. La plupart sont encore une fois basées sur la spectrophotométrie: -Méthodes spécifiques (enzymatiques)= les plus utilisées en médecine: Glucose oxydase Hexokinase Glucose déshydrogénase  Utilisée au TP -Méthodes aspécifiques dosant tous les oses présents en utilisant leur pouvoir réducteur (surtout fonction aldéhyde): méthode de Fehling (adaptée), de Somogyi, de Brown… Détail dias suivantes Détail dia suivante

64 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum D-glucose Oxydation Acide D-gluconique CHALEUR Liqueur de Fehling BLEUE OSE Diminution de la couleur bleue  Mesure absorbance 650 nm Exemple du glucose: précipité Etape supplémentaire (Méthode de SOMOGYI et BROWN) Dosage du Cu2O par colorimétrie  spectrophotométrie Rem: possibilité de mesurer masse d’oxyde de cuivre apparu. Méthodes aspécifiques: détails (pour info):

65 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Détails sur les méthodes enzymatiques: Glucose oxydase (GOD) pour info: 2 techniques de mesure de la glycémie: - approximative : bandelettes de contrôle visuel - précise: bandelettes pour glucomètre colorimètre D-gluconolactone Bandelette colorées Contrôle visuel Glucomètre colorimétrie que

66 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Détails sur les méthodes enzymatiques: Glucose oxydase (GOD) suite: Variante :bandelette contenant ferricyanure et glucose oxydase  glucomètre à électrodes: β-D-glucose acide gluconique GOD(ox) GOD(red) ferrocyanure ferricyanure e- Lecteur mesurant le courant (transfert d’électrons e- ) généré Non spécifique mais très fiable et d’utilisation très commune en biologie médicale Hexokinase :

67 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Détails sur les méthodes enzymatiques: Glucose déshydrogénase: D-GlucoseD-gluconolactone Mesure absorbance à 340 nm  augmentation au cours de la réaction Méthode spécifique et très directe, utilisée ici au TP : T (min) 0.5 1 1.5 A Concentration glucose faible Concentration glucose forte La vitesse d’apparition du NADH (= Δ A ech/min) est strictement proportionnelle à la concentration en glucose de l’échantillon (=[glucose éch] ) Δ A ech /min = constante [glucose éch]

68 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Méthode de la glucose déshydrogénase, protocole de TP: R1 500 µl  Std 10 µl  Mélanger et incuber 1 min  100 µl  Mélanger et incuber 1 min  Lire l’absorbance toutes les 30’’ pendant 10 min GDH R2 NAD+ Etape 1: mesure de l’augmentation de l’absorbance en fonction du temps pour un échantillon de concentration connue en glucose Tracer le graphique A= f(T) sur papier millimétré

69 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Méthode de la glucose déshydrogénase, protocole de TP: Etape 2: Faire la même chose avec l’échantillon de concentration inconnue en glucose Etape 3: Déterminer à partir du Graphique réalisé la concentration en glucose de l’échantillon inconnu

70 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Le glucose fait partie des glucides; c’est un monosaccharide de la famille des hexoses. Il constitue la principale source d’énergie des cellules en étant métabolisé entre autre par la voie de la glycolyse. Le glucose est normalement le principal sucre du sang. Il va être stocké dans les cellules sous forme de glycogène et ne se retrouvera à l’état de glucose que dans le milieu extracellulaire. Biologie du glucose

71 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Régulation de la glycémie Régulation précise: Libération versus stockage sous forme de glycogène et de graisse (foie), glycogène (muscles) ou graisse (tissus adipeux). Sous le contrôle d’hormones Régulation plus grossière: -consommation par tissus périphériques -Absorption intestinale ( repas) -Excrétion rénale ( dépassement seuil de réabsorption)

72 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum AdrénalineMyocyte Glucagon Hépatocyte Adipocyte Insuline Cortisol (Action moléculaire voir cours) Hépatocytes (activation des Enzymes de la néoglucogenèse) Adipocytes (activation de la lipolyse) + sur kinase + sur phosphorylase  glycogénolyse - Sur glycogène synthase + sur phosphatase + sur glycogène synthase Mécanismes et voies de régulation (pour info) Hyperglycémiants Hypoglycémiants Cellule Mécanisme

73 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum Homme: 75-115 mg/dl ou 4.2-6.4 mmol/l Chien: 76-119 mg/dl Chat: 60-120 mg/dl Cheval: 62-134 mg/dl Bovin: 40-100 mg/dl Valeurs normales: Tube pour prélèvement: Dans un prélèvement de sang, la glycémie n’est pas stable et diminue rapidement. A votre avis pourquoi? On doit utiliser un additif spécial: lequel et comment fonctionne-t-il? la glycémie en biologie clinique

74 TP-4: Dosage du glucose dans le sérum la glycémie en biologie clinique Pour quelles raisons la glycémie pourrait-elle sortir des normes?