Représentation d’une méthode de chimie analytique pour le module de méthodes de séparations analytiques Hubert Girault Présentée par : Mouhoub Amar étudiant.

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1 Représentation d’une méthode de chimie analytique pour le module de méthodes de séparations analytiques Hubert Girault Présentée par : Mouhoub Amar étudiant en post-grade à l’IPS. École des Sciences Criminelles Université de Lausanne - bâtiment de chimie 1015 Lausanne - Dorigny.

2 Le plan. 1- Définitions. 2- La PCR un procédé d’amplification. 3- La PCR en temps réel. 4- Champ d’application. 5- Conclusion. 6- Références.

3 >Real Time Polymerase chain reaction, appelée aussi qr-PCR (Quantitative real time PCR) : Est une méthode quantitative en temps réel des amplifiats de la PCR. >Mais la RT-PCR est aussi la Reverse transcription –PCR. >1- 2- La Transcription. >La transcription est la synthèse de l’ARN sous la direction de l’ADN. Les deux acides nucléiques utilisent le même langage (dans l’ARN la base T est remplacé par U). la molécule d’ARN qui en résulte représente une transcription des instructions fournies par le gène pour la construction d’une protéine. Ce type de molécule d’ARN est appelé ARN messager (ARNm), qui se fait transcrit par des enzymes appelées ARN polymérase. 1- Définitions. >1- 1- RT-PCR :

4 ADNADN 1- 2- La transcription 1- Définitions.

5 ADNADN ARNm 1- 2- La transcription 1- Définitions. La transcription

6 ADNADN ARNm Protéines 1- 2- La transcription 1- Définitions. La transcription

7 >1- 3- Reverse Transcription : (La reverse transcription) >Certains virus à ARN appelés rétrovirus présente un sens à ``l’envers`` de la circulation de l’information génétique, grâce à une enzyme spécifique nommé reverse transcriptase, qui transcrit de l’ADN à partir d’une matrice d’ARN. L’ADN nouvellement formé s’intègre alors sous forme de provirus dans le génome de la cellule infectée par ce virus. Cette enzyme est exploitée en biologie moléculaire dans les réactions de reverse transcription suivie de PCR (RT-PCR). 1- Définitions.

8 1- 3- La RT (reverse transcription) ARN 1- Définitions.

9 1- 3- La RT (reverse transcription) ARN ADNADN 1- Définitions. Reverse transcription

10 1- 3- La RT (reverse transcription) ARN ADNADN Intégration 1- Définitions. Reverse transcription

11 >2- 1- La PCR. >La PCR est l’amplification enzymatique ``In vitro´´. Appellée en anglais Polymerase chain reaction cette réaction enzymatique conduit à une amplification spécifique d’une séquence nucléotidique donnée (amplifiats). >2- 2- La découverte de PCR. >Le concept technologique a été découvert par Kary Mullis en 1983. aujourd’hui, la méthode est devenue l’une des techniques de bases pour ne pas dire l’une des techniques de référence, pour un large spectre d’application en biologie moléculaire. 2- La PCR un procédé d’amplification.

12 >2- 3- Principe de la PCR : La réaction enzymatique PCR nécessite. >_ Un extrait d’ADN. >_ l’enzyme : ADN polymérase (Ampli Taq de la bactérie Thermus aquaticus). >_ Deux amorces (Primers). >_ dNTP : les différentes nucléotides (A, T, C & G). >_ Tampon (Buffer) qui assure un PH optimale (8-9) ainsi que la présence d’ions Mg² +. 2- La PCR un procédé d’amplification.

13 2- 3- Principe de la PCR : La réaction enzymatique PCR nécessite. _ Un extrait d’ADN. _ l’enzyme : ADN polymérase (Ampli Taq de la bactérie Thermus aquaticus). _ Deux amorces (Primers). _ dNTP : les différentes nucléotides (A, T, C & G). _ Tampon (Buffer) qui assure un PH optimale (8-9) ainsi que la présence d’ions Mg²+. PCR Mix

14 2- La PCR un procédé d’amplification. 2- 4- La Reverse Transcription – PCR. Voici une animation de la réaction enzymatique Reverse Transcription suivie d’une PCR (RT – PCR) ``In vitro´´.

15 L’ADNc Double brin AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT Une Amorce d’Oligo dT s’hybride avec l’ARNm La Reverse Transcriptase (RT) copie le 1 er brin d’ADNc La Reverse Transcriptase digère et remplace l’ARNm et copie le second brin d’ADNc Conversion de l’ARNm en ADNc par la Reverse Transcription

16 A. ADN double brin. B. Dénatur- -ation 96º 50º C. Hybrida- -tion des amorces 50º D. Liaison de la Polymerase 72º Taq

17 72º Taq E. Copiage des brins 1 2 3 4 F.Dénatu- -ration 96º 1 er cycle de synthèse d’ADNc (2 double brains) Taq

18 1 2 3 4 50º G.Hybridation des amorces

19 1 2 3 4 Taq 72º H. Liaison de la Polymerase

20 1 2 3 4 Taq I. Copiage des brins 72º 2 ème cycle de synthèse de ADNc (4 doubles brins)

21 1 2 3 4 J. Dénaturation à 96º Hybridation des amorces à 50º

22 1 2 3 4 72º K. Liaison de la polymerase (non montré) et copiage des brins 3 ème cycle de synthèse d’ADNc (8 doubles brins)

23 1 2 3 4 L. Dénaturation à 96º Hybridation des amorces à 50º

24 1 2 3 4 M. Copiage des brins à 72º 4 ème cycle de synthèse (16 doubles brins) 72º

25 1 2 3 4 Les doubles brins d’ADNc (16) sont représentés sous forme de lignes

26 1 2 3 4 Après 5 ème cycle ces 32 doubles brins dont 24 (75%) ont la même taille

27 2- La PCR un procédé d’amplification. 2- 5- Représentation de la quantité d’ADN double brin à différents cycles d’amplification.

28 2- La PCR un procédé d’amplification. 2- 6- Représentation graphique. 2- 7- Échelle logarithmique 2- 5- Représentation de la quantité d’ADN double brin à différents cycles d’amplification.

29 2- La PCR un procédé d’amplification. 2- 6- La PCR traditionnel est seulement semi quantitative. La PCR conventionnel ne peut Pas être considéré une analyse quantitative et les résultats sont habituellement exprimés en termes de positivité / négativité. Une évaluation sémi-quantitative est possible sur la base de l'aspect de positivité (faible/forte) de bande électrophorétique, mais cette approche est fortement subjective et la sensibilité est très basse.

30 >3- 1- Principe. >Higuchi & al, 1992, ont été les pionniers de l'analyse de la cinétique de la PCR en concevant un système qui détecte les produits de PCR. Ce système « en temps réel » a utilisé le bromure d'éthidium qui se lie aux quantités croissantes d'ADN bicaténaire amplifiée, ayant pour résultat une augmentation de la fluorescence. 3- La PCR en temps réel

31 3- 1- les méthodes de détections. a- SYBER Green. Le SYBER Green est un colorant luminescent qui se lie à l’ADN double brin mais pas à l’ADN simple brin où la florescence devient plus forte et plus sensible que le bromure d’éthidium. Utilisé pour contrôler la synthèse d’ADN durant la réaction PCR en temps réel (RT-PCR). 3- La PCR en temps réel

32 > b- TaqMan. >La méthode de TaqMan est basée sur l’activité 5’-3’ exonucléase la de l’ADN polymérase (AmpliTaq) qui clive une sonde doublement marquée hybridé à la séquence cible pendant l'amplification de la PCR. Cette méthode à l’avantage d’être spécifique de l’ADN amplifié comparé au SYBER Green qui peut se lie aussi aux produits non spécifique de la PCR. 3- La PCR en temps réel 3- 1- les méthodes de détections. a- SYBER Green.

33 3- La PCR en temps réel

34 >Après extraction d’ADN, l’extrait d’ADN est ajouté à un mélange de la réaction PCR (PCR Mix ) contenant les composants standard de PCR plus une sonde qui s’hybride à la matrice entre les deux amorces (cf schéma). Cette sonde contient un colorant fluorescent de signal à l’extrémité 5 ' (6- carboxyfluorescein, 6-FAM ; émission λ max = 518 nm) et un colorant ``Quencher´´ (extincteur) à l’extrémité 3‘, 6- carboxytetramethylrhodamine, TAMRA ; émission λ max = 582 nm) L'extincteur peut seulement éteindre la signal de fluorescence quand les deux colorants sont près l'un de l'autre. C'est seulement dans le cas d'une sonde intacte. Une fois que l'amplification se produit, la sonde est dégradée par l'activité 5 '- 3 ' exonuclease de l’ADN polymérase (AmpliTaq), et la fluorescence sera détecté à l'aide d'un laser intégré dans le détecteur de séquence. 3- La PCR en temps réel b- TaqMan. b- 1- Principe de la méthode TaqMan.

35 >Il y a beaucoup d’appareil de PCR en temps réel disponibles et celui montré ci dessous est l'ICycler® de BioRad. Le couvercle glisse pour placer la plaque des échantillons de 96 puits. Ce qui permet d’analyser plusieurs échantillons simultanément. 3- La PCR en temps réel 3- 2- Description d’un appareil.

36 L’appareil est doté d’un détecteur sensible qui surveille la florescence dans chaque puit de la plaque à chaque cycle d’amplification. 3- La PCR en temps réel 3- 2- Description d’un appareil.

37 >La courbe obtenus (grand carré) est identique à la courbe théorique (petit carré) ; de même pour la courbe en échelle logarithmique. 3- La PCR en temps réel 3- 3- les résultats obtenus à l’aide d’un appareil de ``Bio-Rad ICycler΄΄ de RT-PCR.

38 >Ce graphe montre une série de dilution de 10 X d’un échantillon d’ADN. >Plus l’échantillon est dilué il faut plus de cycle pour que l’amplification soit discernable. >Ainsi, la quantification de la quantité d’ADN dans l'échantillon initial doit être faite où l'amplification est logarithmique, nous mesurons le nombre de cycle auquel l'augmentation de la fluorescence (et donc d’ADN) est logarithmique. Ceci est montré par le trait horizontal orange dans la figure (le seuil) et est placé par l'utilisateur. Le point auquel la fluorescence croise le seuil s'appelle la Ct. >Le même graphe précédent mais sur une échelle logarithmique 3- La PCR en temps réel 3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?

39 >On peut maintenant tracer les valeurs de Ct en fonction de la concentration d’ADN. La courbe est une droite (R = 0,990). 3- La PCR en temps réel 3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?

40 >On peut déduire la quantité d’ADN qu’on a amplifié par PCR d’un échantillon en extrapolant sa valeur Ct sur cette droite. Pour une valeur Ct = 25 cycle on a log q = 4 donc q = 10000 copies d’ADN. 3- La PCR en temps réel 3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?

41 >Voici une série de calcul du taux d’ADN qui sera théoriquement amplifié à différentes efficacités. Une petite différence dans l’efficacité de 10% induit une grande perte de 80% d’ADN amplifié après 30 cycles. 3- La PCR en temps réel 3- 5- L’effet de l’efficacité sur la PCR.

42 >1- La Real Time - PCR a été utilisé chez l'homme pour mesurer la charge virale pour le diagnostic des différentes maladies provoquées par des virus à ADN tels que : CMV, HIV, HCV et HBV. >la surveillance des patients présentant l'infection du CMV a démontré que le nombre de copie d'ADN de CMV a changé proportionnellement avec la thérapie anti-CMV, confirmant que cette technique est tout à fait utile pour diagnostiquer le début des maladies liées au CMV et surveiller la réactivation de virus chez les patients présentant les infections CMV latentes. >2- la Real Time - PCR peut être utile pour l’étude des phénomènes immunologiques se produisant pendant la l'immunothérapie basé sur les peptides HLA de classe I, par la mesure du niveau de transcription de l'interféron-gamma (IFN-γ). 4- Champ d’application.

43 >3- Travail personnel en science forensique. >La Reverse Transcriptase - PCR peut être utilisé pour la détection des ARNm exprimés dans un type de cellules donnés notamment la salive qui exprime de manière spécifique 5 gènes rapportés dans la littérature 1, qui peut s’avérer très utile dans l’identification des fluides biologiques contenus dans les traces biologiques. l’aspect quantitatif de la Real Time - PCR peut permettre l’évaluation des taux d’ARNm dans une quantité donnée de salive (volume ou nombre de cellule) a fin de remplacer les tests biochimiques conventionnels qui on une sensibilité de : 1/10µl de salive. 1 : J. Juusolaa, J. Ballantyne. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci. Int. 135 (2003) 85–96. 4- Champ d’application.

44 >La Réél time PCR ou PCR quantitative en temps réel permet une quantification extrêmement sensible des niveaux de transcription d’un gène cible en quelques heurs avec une manipulation minimale d’échantillon qui diminue par conséquence les risques de contaminations. 5- Conclusion.

45 >Et merci pour votre attention. 1- D. Larzul, La PCR un procédé d’amplification ``In vitro´´, 1993 Technique et documentation – Lavoisier. Paris. 2- M. Provenzano et al, The Usefulness of Quantitative Real Time PCR in Immunogenetics. ASHI Quarterly, Third Quarterly, 2001. 3- www. med. SC. edu85 / pcr / real time-home.htm. 5- Références.