Dr Erwan Dumontet 2016 Grandes lignes de l’exploration en immunologie.

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1 Dr Erwan Dumontet Erwan.dumontet@gmail.com 2016 Grandes lignes de l’exploration en immunologie

2 I.Anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, PNN, Mono Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines II.Anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, Phagocytes Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines III.Diagnostics in vitro Test d’activation des basophiles Elispots

3 I.Anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, PNN, Mono Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines II.Anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, Phagocytes Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines III.Diagnostics in vitro Test d’activation des basophiles Elispots

4 Recherche anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Lymphocytes – Polynucléaires – Monocytes Molécules sanguines – Complément – Immunoglobulines

5 Recherche anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Lymphocytes – Polynucléaires – Monocytes Molécules sanguines – Complément – Immunoglobulines Hémogramme (= NFS) Cytométrie en flux

6 L’hémogramme

7 Cytomètre en flux Système fluidique : mise en flux d’une suspension unicellulaire Système optique : lasers, filtres récupération signal Système d’analyse

8 Applications Analyse quantitative : – Taille – Structure – Plusieurs fluorescences – Rapide – Quantification absolue à l’aide de billes/étalon

9 Principe Déviation à 180° Taille Déviation à 90° Structure interne Lumière cohérente (laser)

10 Principe FL 3 FL 1 FL 2 Structure LASER Flux Taille

11 Principe FL 3 FL 1 FL 2 Structure LASER Flux Taille 90° 180°

12 Cytométrie en flux Taille Structure (granulosité) Lymphocytaire Monocytaire Granulocytaire

13 Caractérisation immunophénotypique CD4 CD3CD19

14 Principe FL 3 FL 1 FL 2 Structure LASER Flux Taille 90° 180°

15 Principe La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l'excitation à une longueur d’onde donnée d'une molécule (généralement par absorption d'un photon) immédiatement suivie d'une émission spontanée à une longeur d’onde plus élevée. 488nm

16 Cytomètrie en flux Fluorescence phycoérythrine Nombre d’évènements % évènements +

17 Les anticorps monoclonaux Intérêt : Reconnaissance d’un seul déterminant antigénique Ac murins

18 Exemples d’applications Quantification des sous-populations lymphocytaires Numération des T CD4 et du ratio CD4/CD8 pour suivi infection VIH Suivi d’une déplétion lymphocytaire par traitement immunosuppresseur Immunoglobulines anti-thymocytes humains Rituximab Déficits immunitaires Agammaglobulinémies

19 Recherche anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Lymphocytes – Polynucléaires – Monocytes Molécules sanguines – Complément – Immunoglobulines

20 C3a CR3 RC5a RC3a CR1 C3b C3 Voie classique C1q, C1r, C1s Voie des Lectines/Ficolins Voie alterne Hydrolyse spontanée C3 convertase Classique C4bC2a C3 convertase Alterne C3bBb C3 C3b Facteur I et Facteur H CD46 Facteur I et Facteur H CD46 iC3b C5 C3a OpsonisationLyseChimiotactisme C5b-CAM C5a Facteur B et Facteur D Facteur B et Facteur D C1 inhibiteur CR1 DAF C4bp CR1 DAF C4bp C5 convertase C3bBb(C3b)n C5 convertase C4bC2a(C3b)n iC3b 20 Le complément

21 Dosages quantitatifs des fractions Néphélémétrie (visualisation d’un immunoprécipité en milieu liquide) Photomultiplicateur (diffraction de la lumière de 7 à 10°) Faisceau laser

22 Caractéristiques de la liaison Ag-Ac Types de liaison intervenants Electrostatiques, Hydrogènes, Hydrophobes, Van der Waals Autres propriétés Réaction spécifique, réversible

23 Principe de la zone d’équivalence [Ac] constante [Ag] [Ag-Ac] Excès d’Ag Excès d’Ac Equilibre ou équivalence Ag + Ac Ag-Ac

24 Dosages quantitatifs du C2… Immunodiffusion radiale [Ag], mg/ml Diamètre de l’anneau 1mg/ml2mg/ml3mg/ml4mg/ml Ac contenu dans la gélose Xmg/ml

25 Applications Syndrome inflammatoire Déficit en C3, C4… Cryoglobuline Maladies auto-immunes…

26 Recherche anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Lymphocytes – Polynucléaires – Monocytes Molécules sanguines – Complément – Immunoglobulines

27 Electrophorèse des protéines

28 Quantification des classes et sous-classes d’immunoglobulines Néphélémétrie Applications – Recherche d’une gammapathie monoclonale – Dépistage des déficits immunitaires (agammaglobulinémie ou hypogammaglobulinémie)

29 I.Anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, PNN, Mono Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines II.Anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, Phagocytes Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines III.Diagnostics in vitro Test d’activation des basophiles Elispots

30 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : activité CH50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

31 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : CH50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

32 Sous-populations lymphocytaires B sanguines LyB Naïf CD45 CD19 CD27 IgD LyB Mémoire Non switché CD45 CD19 IgD IgM CD27 LyB Mémoire Switché CD19 CD27 LyB Mémoire Switché CD19 IgE CD27 LyB Mémoire Switché CD19 IgA IgG

33 Sous-populations lymphocytaires B sanguines Visualisation par cytométrie en flux LyB Naïfs LyB Mémoire Non Switch Switch

34 Sous-populations lymphocytaires B sanguines Application : Recherche d’un syndrome d’hyper-IgM – Recherche d’un défaut de commutation isotypique – Déficit AID

35 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : CH50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

36 Test de transformation lymphoblastique (TTL) But : visualisation de la capacité proliférative in vitro des lymphocytes T suite à une stimulation par – des mitogènes – des antigènes de rappel Utilisation de thymidine tritiée 3 H – Quantification de la RA incorporée dans le noyau de la cellule Indication – Recherche d’un déficit immunitaire combiné

37 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : CH50 et AP50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

38 Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des phagocytes Evaluation en cytométrie en flux Adhérence – Phénotypage des molécules d’adhérence leucocytaires Phagocytose – Mise en contact in vitro cellules leucocytaires + E. Coli fluorescentes – Visualisation par cytométrie en flux des bactéries phagocytées Burst oxydatif – E. Coli non fluorescentes comme catalyseur ou PMA – Dihydrorhodamine 123 : substrat fluorogénique

39 Activité phagocytaire E COLI 4° FITC FSC SSC CD14

40 Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des phagocytes Evaluation en cytométrie en flux Adhérence – Phénotypage des molécules d’adhérence leucocytaires Phagocytose – Mise en contact in vitro cellules leucocytaires + E. Coli fluorescentes – Visualisation par cytométrie en flux des bactéries phagocytées Burst oxydatif – E. Coli non fluorescentes comme catalyseur ou PMA – Dihydrorhodamine 123 : substrat fluorogénique

41 Polynucléaires Monocytes Non stimulés Après phagocytose d’E Coli Oxydation de la DHR 123 Burst oxydatif

42 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : CH50 et AP50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

43 Tests fonctionnels du compléments: CH50 et AP50 Mesure de l’activité totale du complément par des tests hémolytiques Principes – Lyse de globules rouges et mesure hémoglobine libérée – Quantité de sérum qui permet d’obtenir 50% d’hémolyse par rapport à un sérum humain normal Indications – Déficit en fraction du complément, – Déficits immunitaires, – SHU, aSHU

44 La voie classique :exploration par dosage CH50 Fixation et activation du complément Sérum patient Complément Lyse des hématies Libération d’hémoglobine mesure la DO à 540 nm Le complément contenu dans le sérum testé se fixe et provoque la lyse des hématies. Le % de lyse est proportionnel à la quantité de complément contenu dans le sérum à tester.  % d’activité par rapport à un pool de sérums humains témoins. Hématies de mouton sensibilisées 44

45 Fixation et activation du complément Sérum patient Complément Lyse des hématies Libération d’hémoglobine mesure la DO à 540 nm Le complément contenu dans le sérum testé se fixe et provoque la lyse des hématies. Le % de lyse est proportionnel à la quantité de complément contenu dans le sérum à tester.  % d’activité par rapport à un pool de sérums humains témoins. Hématies de lapin 45 La voie alterne : exploration par dosage AP50

46 Recherche anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang – Sous-populations lymphocytaires T et B – Test de transformation lymphoblastique – Activité migratoire, phagocytaire et oxydative des cellules phagocytaires Molécules sanguines – Complément : CH50 – Immunoglobulines Recherche IgE spécifiques Recherche d’autoanticorps

47 Quantification des IgE spécifiques d’allergènes Indications – Hypersensibilités IgE dépendantes Valeur clinique – Visualisation de la sensibilisation à un allergène – Suivi - Evolution de l’hypersensibilité

48 Quantification des IgE spécifiques d’allergènes http://www.phadia.com 1. Allergène fixé sur support solide, ajout sérum patient contenant IgE 2. Lavage des IgE non spécifiques, ajout anticorps anti IgE marqués par une enzyme 3. Lavage après incubation, ajout d’un substrat 4. L’enzyme dégrade le substrat en produit fluorescent Lecture de la fluorescence présente, proportionnelle à la concentration d’IgE présente dans le sérum Technique ELISA sandwich

49 Recherche d’autoAc spécifique Indications – Diagnostic biologique et suivi de maladies auto- immunes Techniques – Immunofluorescence indirecte ou ELISA

50 Recherche d’auto-anticorps anti-nucléaires Centromère

51 Sensibilité des différentes techniques Technique Seuil de détection d’un Ag (µg/ml) ELISA0.0001 Immunofluorescence0.1 Précipitation (milieu gélifié)3-10 Précipitation (milieu liquide)20

52 I.Anomalies quantitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, PNN, Mono Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines II.Anomalies qualitatives de l’immunité Eléments figurés du sang : Lymphocytes, Phagocytes Molécules sanguines : Complément, Immunoglobulines III.Diagnostics in vitro Test d’activation des basophiles Elispots

53 Test d’activation in vitro des basophiles – Test de seconde intention – Recherche d’hypersensibilité de type I à un allergène – Principe : Technique fonctionnelle in vitro Mise en contact basophiles sanguins / allergène Visualisation par cytométrie en flux d’un marqueur de d’activation ou de dégranulation Hypersensibilité : TAB

54 Test d’activation in vitro des basophiles Hypersensibilité : TAB CD203c FSC SSCCD3 CRTH2

55 Diagnostic in vitro de la tuberculose Mesure in vitro de la libération d’IFN-  par les cellules T sensibilisées à 2 peptides spécifiques de Mycobactérium tuberculosis, mais absents du BCG et des Mycobactéries non tuberculeuses. Sensibilité 95%Spécificité 99% Indications : – Exclusion ou confirmation des tests à la tuberculine positifs – Dépistage d’une infection latente après vaccination BCG – Avant traitements immuno-suppresseur (anti-TNF, transplantation) – Immunodéprimés

56 Représentation schématique de l’ELISpot (Enzyme-linked immunospot )

57 Résultat d’ELISpot dans la vraie vie