C. Types d’observations réalisables grâce aux microscopes

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2 C. Types d’observations réalisables grâce aux microscopes

3 1) On veut étudier la structure générale d’un tissu ou d’une cellule
Selon le niveau souhaité, on fera par exemple une coupe colorée observée au microscope optique, ou une coupe ultrafine contrastée observée au microscope électronique pour voir les organites. . Bactérie : Shigela Le noyau 28/04/17 GUEDES Isabel

4 2) On veut localiser des familles moléculaires ou des molécules spécifiques dans la cellule
a) Histochimie utilisée principalement pour la microscopie optique mettre en évidence des constituants biochimiques : glucides, acides nucléiques 28/04/17 GUEDES Isabel cellules glandulaires (contenant des glycoprotéines= mucus), colorées à PAS (le mucus est coloré par mise en évidence des résidus glucidiques). cellules glandulaires (contenant des glycoprotéines= mucus), colorées à l’hématoxyline- éosine (le mucus est clair)

5 b) Histoenzymologie permet de détecter une enzyme par le produit obtenu au cours de la réaction enzymatique à partir d’un substrat qu’on a fourni. Exemples : • En microscopie optique : mise en évidence des peroxydases dans des cellules d’origine sanguine • En microscopie électronique à transmission : mise en évidence des phosphatases acides dans les lysosomes 28/04/17 GUEDES Isabel

6 c) Immunocytochimie permet de localiser dans une cellule, dans un tissu, une molécule spécifique (l’antigène) grâce à sa reconnaissance spécifique par un anticorps. 28/04/17 GUEDES Isabel α ) Les anticorps Les anticorps sont produits par les plasmocytes, résultant de la différenciation terminale des lymphocytes B. Un anticorps de manière schématique, est constitué de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères déterminant deux domaines structuraux et fonctionnels : deux sites de reconnaissance de l’antigène, un fragment Fc impliqué in vivo dans les fonctions effectrices. Il y a 5 types d’anticorps :, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Les plus utilisés pour l’immunocytochimie sont les IgGs

7 β ) Obtention des anticorps
Obtention des anticorps polyclonaux On injecte à un animal l’antigène contre lequel on veut obtenir des anticorps. L’animal va réagir contre cette molécule étrangère pour lui en fabriquant des anticorps dirigés contre les différents épitopes de l’antigène. Chaque clone de lymphocytes B différencié en plasmocytes synthétisera un anticorps avec une spécificité donnée. 28/04/17 GUEDES Isabel

8 Obtention des anticorps polyclonaux
Au bout de quelque temps, on prélève du sang et on sépare le sérum qui contient les anticorps circulants. Pour une utilisation optimale des anticorps, il faut les purifier Une colonne est remplie de billes sur lesquelles on a fixé l’antigène qui a servi à fabriquer l’anticorps. On fait passer le sérum sur la colonne, les anticorps spécifiques seront retenus dans la colonne, les autres seront éliminés, puis on sépare les anticorps des billes. 28/04/17 GUEDES Isabel

9 β ) Obtention des anticorps Les anticorps monoclonaux
28/04/17 GUEDES Isabel On injecte à un animal (lapin, chèvre……) l’antigène contre lequel on veut obtenir des anticorps. L’animal va réagir contre cette molécule étrangère pour lui en fabriquant des anticorps dirigés contre les différents épitopes de l’antigène. Chaque clone de lymphocytes B différencié en plasmocytes synthétisera un anticorps avec une spécificité donnée. Au bout de quelque temps, on prélève du sang et on sépare le sérum qui contient les anticorps circulants. Pour une utilisation optimale des anticorps, il faut les purifier.

10 Les anticorps monoclonaux
On obtient ainsi trois types de cellules : des lymphocytes B qui ne se sont pas hybridés et qui vont mourir car ce sont des cellules post-mitotiques, des cellules tumorales qu’on va empêcher de proliférer en les cultivant dans un milieu spécifique, et des hybrides qui auron la double potentialité : la prolifération même en milieu spécifique et la synthèse d’anticorps. On va cultiver les hybrides, tester les surnageants à la recherche de l’anticorps monoclonal intéressant pour l’application qu’on a choisie, jusqu’à l’obtention du clone intéressant. Ce clone pourra être maintenu indéfiniment et produira indéfiniment le même anticorps monoclonal. 28/04/17 GUEDES Isabel

11 γ ) La liaison antigène-anticorps
De nombreuses liaisons non covalentes participent à la liaison antigène-anticorps (liaisons hydrogène, forces de van der Waals, forces électrostatiques) qui individuellement sont faibles mais qui collectivement donnent une énergie de liaison forte. 28/04/17 GUEDES Isabel

12 δ ) Les systèmes de visualisation : les marqueurs
on va utiliser des marqueurs adaptés aux différents microscopes que l’on veut utiliser. Enzymes Leur principe est basé sur une réaction histo-enzymologique décrite précédemment : on apporte à l’enzyme un substrat qui donnera un produit coloré en présence de l’enzyme. L’enzyme très fréquemment utilisée est la peroxidase de raifort. L’observation se fera habituellement au microscope optique. Fluorochromes pour la microscopie à fluorescence et le microscope confocal Pour la microscopie électronique On peut utiliser de la peroxidase avec comme chromogène la DAB qui est opaque aux électrons ou mieux, des billes d’or colloïdal, d’un diamètre de 1 à 20 nm. Les billes de 1 nm n’étant pas visibles dans les microscopes électroniques de routine, on amplifie par le dépôt de sels d’argent. 28/04/17 GUEDES Isabel

13 ε ) Mode opératoire : avec amplification ou non de la réaction antigène-anticorps
Méthode directe L’anticorps spécifique de l’antigène est appelé l’anticorps primaire. Dans les méthodes directes, on couple l’anticorps primaire avec un marqueur, souvent un fluorochrome. La réaction se fait donc en une étape : on applique l’anticorps marqué sur la coupe, on laisse incuber, on rince et on met une lamelle, la coupe peut être observée. Cette technique directe est utilisée quand la quantité d’antigène dans la coupe ou les cellules est très importante ; elle est surtout utilisée en diagnostic. 28/04/17 GUEDES Isabel

14 Méthodes indirectes Il existe plusieurs méthodes permettant d’amplifier le signal ; nous prendrons un exemple : amplification par le système avidine-biotine avec la peroxidase comme marqueur. L’avidine (ou actuellement la streptavidine) est une glycoprotéine qui a une grande affinité pour une petite vitamine, la biotine. L’avidine peut lier 4 biotines. D’autre part, la biotine peut être conjuguée à des protéines et donc aux anticorps. Dans cette technique d’amplification, on va procéder en trois étapes : 28/04/17 GUEDES Isabel 1ère étape : liaison de l’anticorps primaire à l’antigène ; dans notre exemple : anticorps monoclonal produit chez la souris 2ème étape : liaison d’un anticorps secondaire biotinylé dirigé contre l’espèce de l’anticorps primaire : anticorps produit chez la chèvre anti-immunoglobulines de souris 3ème étape : streptavidine peroxydase La révélation se fera grâce à un chromogène en présence d’H2O2

15 d) Hybridation in situ Cette technique permet de mettre en évidence des séquences d’acides nucléiques, ADN ou ARN, grâce à la complémentarité des chaînes. L’outil utilisé sera une sonde (ADN, ARN, oligonucléotide) et la visualisation se fera soit par autoradiographie (sonde chaude, radioactive), fluorescence (marquage par un fluorochrome) ou chromogène en cas de marquage par une enzyme. 28/04/17 GUEDES Isabel

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17 e) Autoradiographie Technique d'imagerie ayant pour but de marquer une activité cellulaire au sein du cytoplasme de la cellule grâce à des marqueurs ou des traceurs. En biologie, ce sont surtout les particules β qui sont utilisées, de faible énergie H3 ou de haute énergie P32. On utilise la propriété qu’ont les particules émises par le radioélément d’activer une émulsion photographique. On recouvre la coupe qui contient le radioélément par une émulsion photographique ; on laisse ensuite la lame à l’obscurité pour que les particules activent suffisamment le gel de grains d’argent ; on obtient ainsi une image latente qu’on révèle ensuite. 28/04/17 GUEDES Isabel CÉLULAS FOLICULARES

18 II. METHODES DE SEPARATION ET DE PURIFICATION
Pour travailler sur des éléments purs : cellules ou organites 1) Tri cellulaire a) Première étape : obtention d’une suspension cellulaire à partir d’un organe ou d’un tissu On fait agir des enzymes, des chélateurs du calcium ou on réalise une séparation mécanique. b) Le tri : principe général Le but est d’obtenir une population cellulaire purifiée permettant ensuite de nombreuses applications. Exemple d’un trieur de cellules marquées par la fluorescence Les cellules marquées vont passer une à une devant un faisceau laser qui active la molécule fluorescente ; un détecteur permet d’analyser la lumière émise. Par un système de vibration, les cellules sont englobées dans des gouttelettes qui seront chargées selon la détection de fluorescence et un déflecteur permettra de séparer les populations selon leur charge. Cette technique automatique a un très haut rendement. 28/04/17 GUEDES Isabel

19 Tri cellulaire 28/04/17 GUEDES Isabel

20 Obtention d’un homogénat cellulaire
C’est la première étape, permettant de détruire la membrane cytoplasmique et libérer les organites. α)Par action mécanique : tube de Potter β) Ultrasons (sonication) γ) Par choc osmotique 28/04/17 GUEDES Isabel Les cellules sont laminées entre le piston et la paroi du tube

21 b) Centrifugation différentielle
On va soumettre l’homogénat à une centrifugation différentielle à vitesse et temps croissants afin de séparer progressivement les organites. 28/04/17 GUEDES Isabel