II. Détermination de la structure tridimensionnelle

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1 II. Détermination de la structure tridimensionnelle
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques » II. Détermination de la structure tridimensionnelle

2 Méthodes expérimentales : Obtention de coordonnées atomiques
Cristallographie et diffraction des rayons X Spectroscopie de résonance magnétique

3 Méthodes expérimentales : Obtention de coordonnées atomiques
Cristallographie et diffraction des rayons X Spectroscopie de résonance magnétique

4 Résumé Xtallo Atomes d'hydrogènes absents

5 Avantages et inconvénients Xtallo
Image 3D Pas de limite de taille Protéines fonctionnelles Méthode éprouvée (1960) Plus de structures résolues (PDB 2005) Inconvénients Système moléculaire " figé " (cristal) Zones trop variables invisibles Pureté et quantité des échantillons Travail à basses températures Cristallisation empirique Résolution du problème de phase Méthode relativement longue

6 Méthodes expérimentales : Obtention de coordonnées atomiques
Cristallographie et diffraction des rayons X Spectroscopie de résonance magnétique

7 Etude des protéines par RMN
# # Upper limit restraints of HIV-1 Nucleocapsid Protein bound # to SL3 RNA Recognition Element # NOE restraints for N-terminal 3-10 Helix # Hydrogen Bonds 3 LYS O PHE HN E+00 3 LYS O PHE N E+00 4 GLY O ARG HN E+00 4 GLY O ARG N E+00 5 ASN O ASN HN E+00 5 ASN O ASN N E+00 6 PHE O GLN HN E+00 6 PHE O GLN N E+00 7 ARG O ARG HN E+00 7 ARG O ARG N E+00 8 ASN O LYS HN E+00 8 ASN O LYS N E+00 # HN(i)-HN(i+1) 3 LYS HN GLY HN E+00 4 GLY HN ASN HN E+00 5 ASN HN PHE HN E+00 6 PHE HN ARG HN E+00 7 ARG HN ASN HN E+00 8 ASN HN GLN HN E+00 9 GLN HN ARG HN E+00 10 ARG HN LYS HN E+00 11 LYS HN THR HN E+00 # HA(i)-HN(i+2) 4 GLY HA PHE HN E+00 5 ASN HA ARG HN E+00 6 PHE HA ASN HN E+00 7 ARG HA GLN HN E+00 8 ASN HA ARG HN E+00 Séquence primaire nécessaire + « contraintes » obtenues par l'analyse des spectres RMN

8 Etude des protéines par RMN
# # Upper limit restraints of HIV-1 Nucleocapsid Protein bound # to SL3 RNA Recognition Element # NOE restraints for N-terminal 3-10 Helix # Hydrogen Bonds 3 LYS O PHE HN E+00 3 LYS O PHE N E+00 4 GLY O ARG HN E+00 4 GLY O ARG N E+00 5 ASN O ASN HN E+00 5 ASN O ASN N E+00 6 PHE O GLN HN E+00 6 PHE O GLN N E+00 7 ARG O ARG HN E+00 7 ARG O ARG N E+00 8 ASN O LYS HN E+00 8 ASN O LYS N E+00 # HN(i)-HN(i+1) 3 LYS HN GLY HN E+00 4 GLY HN ASN HN E+00 5 ASN HN PHE HN E+00 6 PHE HN ARG HN E+00 7 ARG HN ASN HN E+00 8 ASN HN GLN HN E+00 9 GLN HN ARG HN E+00 10 ARG HN LYS HN E+00 11 LYS HN THR HN E+00 # HA(i)-HN(i+2) 4 GLY HA PHE HN E+00 5 ASN HA ARG HN E+00 6 PHE HA ASN HN E+00 7 ARG HA GLN HN E+00 8 ASN HA ARG HN E+00 => logiciels de modélisation + « oeil » de l'expert !!! => ~ 200 structures différentes à regrouper en famille => ~ 20 familles dont est choisi un représentant (le plus proche de la structure moyenne de la famille)

9 Etude des protéines par RMN
Structure de la protéine de nucléocapside de HIV-1 liée à l ’élément de reconnaissance SL3 PSI-RNA. RMN 25 structures Code PDB 1A1T

10 Avantages et inconvénients
Protéines en solution Informations des zones très flexibles Inconvénients Limitation en taille de la molécule ( 300 AA au maximum, généralement 100 AA) Pureté et quantité des échantillons Attribution des spectres (parfois longue et difficile)

11 Avantages et limites des 2 méthodes expérimentales
Methodes expérimentales !!! Limites Matériel important et cher Synchrotron pour hautes résolution Xtallo Champs magnétiques de haute intensité pour RMN Grande quantité de l’échantillon (10aine de mg) en RMN Pureté de l’échantillon Absence de modifications post-traductionnelles importantes Point commun : utilisent la modélisation moléculaire pour la résolution des structures à partir de données expérimentales

12 II.2 – Méthodes prédictives = bioinformatique structurale
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques » II. Détermination de la structure tridimensionnelle II.1 – Méthodes expérimentales II.2 – Méthodes prédictives = bioinformatique structurale

13 Bio-informatique structurale : intérêt
Statistiques GenBank Tous organismes confondus Statistiques Uniprot Tous organismes confondus Séquences d'ADN complémentaires ou de prédiction de gènes 2006 : 52 millions de séquences Séquences de protéines « vérifiées » 2006 : séquences

14 Bio-informatique structurale : intérêt
Statistiques PDB Tous organismes confondus Structures de protéines => / séq. prot. => / 52 millions séq. nucl.

15 Prédiction de domaines transmembranaires
Peu de protéines membranaires dans la PDB (~ 200 structures)

16 Bio-informatique structurale
Méthodes de prédiction de structure tridimensionnelle des protéines Recherche du meilleur repliement par itérations successives => Grid Computing (Rosetta) Méthodes de threading => comparaison des séquences avec des banques de repliement Modélisation par analogie structurale => alignement de la séquence de la protéine inconnue => recherche d'une protéine similaire, dont la structure est connue

17 Bio-informatique structurale
Méthodes de prédiction de structure tridimensionnelle des protéines Recherche du meilleur repliement par itérations successives => Grid Computing (Rosetta) Méthodes de threading => comparaison des séquences avec des banques de repliement Modélisation par analogie structurale => alignement de la séquence de la protéine inconnue => recherche d'une protéine similaire, dont la structure est connue

18 Modélisation par analogie structurale
Bases théoriques Statistiques PDB Tous organismes confondus Nombre de topologies CATH => stable depuis 2005 La majorité des nouvelles structures de protéines sont soit des variations, soit des combinaisons d'environ 10 architectures protéiques fondamentales

19 ~95% des protéines peuvent être classées en ~10 structures supersecondaires

20 Deux protéines de séquences similaires auront des structures proches

21 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
Séquence protéique à modéliser 1. Choix d’un analogue structural => recherche dans la PDB (Protein Data Bank) Séquence Structure

22 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences Séquence à modéliser + Template

23 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences Similarité supérieure à 30%

24 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences Régions non modélisables => Pas d’informations structurales

25 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences Régions structurellement conservées => Identifiées par score de similarité + prédiction de structure secondaire

26 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences Régions variables => Identifiées par score de similarité

27 Modélisation par analogie structurale Méthodologie générale
2. Alignement des séquences => Identification des différentes régions sur la séquence à modéliser 3. Obtention des coordonnées atomiques (modélisation moléculaire) Différente suivant les régions : conservées ou variables 3 méthodes : 1. Méthode utlisant le remplacement moléculaire (dérivée de Xtallo) 2. Méthode utilisant des contraintes structurales (dérivée de RMN) 3. Méthode mixte

28 Méthode dérivée des techniques de raffinements cristallographiques :
Remplacement moléculaire Structure cristallographique homologue Boucles extraites de structures de la PDB Régions Structurellement Conservées (SCR) Régions variables (boucles) Coordonnées Minimisations d’énergie (steepest descent et gradients conjugués) Évaluation du modèle final

29 Méthode dérivée des techniques de raffinements cristallographiques :
Remplacement moléculaire Structure cristallographique homologue Boucles extraites de structures de la PDB Régions Structurellement Conservées (SCR) Régions variables (boucles) Coordonnées

30 Méthode dérivée des techniques de résolution de structures RMN :
Application de contraintes Structure cristallographique homologue Boucles extraites de structures de la PDB Régions Structurellement Conservées (SCR) Régions variables (boucles) Contraintes Génération des coordonnées : Dynamique moléculaire et recuit simulé Minimisations d’énergie Évaluation du modèle final

31 Application de contraintes sur les régions structurellement conservées
Méthode mixte : Application de contraintes sur les régions structurellement conservées Remplacement moléculaire pour les régions variables Structure cristallographique homologue Boucles extraites de structures de la PDB Régions Structurellement Conservées (SCR) Régions variables (boucles) Contraintes Coordonnées

32 Extraction de contraintes
Méthode mixte : Application de contraintes sur les régions structurellement conservées Remplacement moléculaire pour les régions variables Structure cristallographique homologue Boucles extraites de structures de la PDB Régions Structurellement Conservées (SCR) + Régions variables (boucles) Contraintes Coordonnées Modèles initiaux Extraction de contraintes “type RMN “ Application des contraintes : Dynamique Moléculaire (recuit simulé) Structures finales Évaluation des structures

33 Résumé : modélisation moléculaire par analogie structurale
Alignement de séquence Recherche d’analogues structuraux dans les banques de données Prédictions de structure secondaire Identification des SCR et des régions variables Modélisation Moléculaire Obtention des coordonnées structurales Evaluation des structures Minimination d'énergie globale Structure(s)

34 Analogues structuraux : > 75 % de similarité
Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H. => TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction. Exemple de modélisation : structure cristallographique absente de la PDB Analogues structuraux : > 75 % de similarité

35 Utilisation de serveurs automatisés
pour la prédiction de la structure des protéines  SWISS-MODEL ( => Méthode de remplacement moléculaire pour toute la séquence  GENO3D ( => Méthode d'extraction de contraintes pour toute la séquence Utilisation d'un logiciel commercial : InsightII (Accelrys) => Méthode mixte Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H. => TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction.

36 Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H.
=> TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction. Structure cristallographique Modèle « mixte » 0,5 Å

37 Modèle Geno3d 1,0 Å Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H. => TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction. Structure cristallographique Modèle Swiss-Model 0,6 Å

38 Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H.
=> TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction. Structure cristallographique Modèle «artisanal» Modèle Swiss-Model Modèle Geno3d

39 Coloration selon le RMS : Structures globalement semblables
Liste des diff.fonc. +cytokinine + actine Et intérêt pour l’H. => TLp de fruits allergisantes et maturation des fruits. T= devant cette multiplicité de propriétés alors que struct prim similaire établissement des relations struct fonction. Coloration selon le RMS : Structures globalement semblables

40 II.3 – Evaluation de la qualité des structures : PROCHECK
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques » II. Détermination de la structure tridimensionnelle II.1 – Méthodes expérimentales II.2 – Méthodes prédictives = bioinformatique structurale II.3 – Evaluation de la qualité des structures : PROCHECK

41 Ramachandran plot                                                                                                                           

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44 III. La génomique structurale
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques » II. Détermination de la structure tridimensionnelle II.1 – Méthodes expérimentales II.2 – Méthodes prédictives = bioinformatique structurale II.3 – Evaluation de la qualité des structures : PROCHECK III. La génomique structurale

45 Relations structure – fonction des protéines
Caractérisation Purification Séquence protéique Relations structure/fonction Clonage Séquence nucléotidique Structure

46 Relations structure – fonction des protéines
Caractérisation => conception de nouveaux médicaments Séquence protéique Relations structure/fonction Séquence nucléotidique Structure => méthodes expérimentales = génomique structurale => méthodes informatiques = bioinformatique structurale à haut débit

47 Génome humain : gènes prédits (avant 2001) gènes après séquençage et annotations gènes selon les derniers calculs (fin 2005) Dogme central : 1 gène -> 1 ARN -> 1 protéine 1 gène -> 1 fonction Après la génomique => la protéomique => Épissage alternatif d'ARN, Modifications post-traductionnelles => 1 gène -> nb protéines ? Estimation => x 4 Protéines humaines dans la PDB => ~ structures uniques

48 Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire II. Détermination de la structure tridimensionnelle III. La génomique structurale Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines

49 Mêmes interactions mises en jeu que pour les structures quaternaires
Essentiellement 3 modes d’interaction :

50 II. Interactions protéines – Acides nucléiques
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – Acides nucléiques II.1 – Rappels sur la structure des acides nucléiques II.1 – 1. L'ADN

51 ADN Forme B

52 Forme B Forme A Forme Z

53

54 Autres formes possibles de l’ADN

55 II.1 – 2. L'ARN Chapitre 1 – Structure des protéines
Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – Acides nucléiques II.1 – Rappels sur la structure des acides nucléiques II.1 – 1. L'ADN II.1 – 2. L'ARN

56 Différentes structures secondaires de l’ARN

57 Structures secondaires de l’ARN
Pseudonoeud Tige boucle (stem loop) Boucle intérieure Simple brin Boucle en bulle (bulge) Boucle en épingle à cheveu (hairpin) Jonction (Multiboucle)

58 Structures tertaires de l’ARN

59 Structure d’un ARNt

60 Structure des ARNr de la grande sous-unité d’un ribosome bactérien
(déterminée par cristallographie et diffraction des rayons X)

61 II.2 – Motifs protéiques de liaison à l'ADN
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – Acides nucléiques II.1 – Rappels sur la structure des acides nucléiques II.1 – 1. L'ADN II.1 – 2. L'ARN II.2 – Motifs protéiques de liaison à l'ADN

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65 Motifs en doigt de zinc

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67 Fermeture à leucine (leucine zipper)

68 Fermeture à leucine (leucine zipper)

69 Fermeture à leucine (leucine zipper)

70 II.3 – Interactions protéines – ARN
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – Acides nucléiques II.1 – Rappels sur la structure des acides nucléiques II.1 – 1. L'ADN II.1 – 2. L'ARN II.2 – Motifs protéiques de liaison à l'ADN II.3 – Interactions protéines – ARN

71 Interaction ARN-Protéines : le ribosome

72 Différentes structures de liaison protéines - ARN

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77 III. Interactions protéines – polysaccharides III.1 – Glycoprotéines
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – acides nucléiques II.1 – Rappels sur la structure des acides nucléiques II.1 – 1. L'ADN II.1 – 2. L'ARN II.2 – Motifs protéiques de liaison à l'ADN II.3 – Interactions protéines – ARN III. Interactions protéines – polysaccharides III.1 – Glycoprotéines

78 Conformations étendues ?
Interactions plus proches ?

79 III. 2 – Carbohydrates binding modules
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – acides nucléiques III. Interactions protéines – polysaccharides III.1 – Glycoprotéines III. 2 – Carbohydrates binding modules

80 Historiquement appelés cellulose binding domain (CBD)
Forment un ou des domaines chez des hydrolases qui dégradent des polysaccharides insolubles Dans leur majorité structurés en β sandwich En général sont constitués d’une fissure chargée négativement

81 Type A => CBM de liaison en surface : plateforme plane AA aromatiques

82 Type B => CBM de liaison à une chaîne glycannique
Fissure en général chargée (-)

83 CBM de type B

84 Type C => CBM de liaison à des monosaccharides ou petits oligosaccharides

85 Spécificité de l’interaction => plateforme d’interaction : AA aromatiques
Plane CBM de type A

86 Spécificité de l’interaction => plateforme d’interaction : AA aromatiques
Twisted Plane

87 Spécificité de l’interaction => plateforme d’interaction : AA aromatiques
Twisted Plane En sandwich

88 Protéine de liaison au xylanne (struture RMN) site actif en violet
2 tryptophanes perpendiculaires, courbure permettant d’interagir avec le xylanne

89 Mutation d’une arginine en glycine => changement de conformation du
Mutation d’une arginine en glycine => changement de conformation du tryptophane noté par une flèche et de la courbure de la protéine => perte de la spécificité et de l’affinité pour le xylane => interaction avec la cellulose cristalline

90 Spécificité de l’interaction => liaisons hydrogènes
=> présence dans les sites actifs de résidus polaires sérine, thréonine, mais aussi des résidus acides et basique maximum de liaisons hydrogènes => Interactions avec des ions calcium

91 Plasticité de l’interaction : flexibilité du polysaccharide
=> Ajustement induit entre la protéine et le polysaccharide

92 Interaction avec un cello-oligosaccharide linéaire

93 Protéine de la même famille fonctionnelle et structurale mais 2 insertions de boucles => reconnaissance de laminarioligosaccharides

94 IV. Modélisation des intéractions entre macromolécules
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – acides nucléiques III. Interactions protéines – polysaccharides III.1 – Glycoprotéines III. 2 – Carbohydrates binding modules IV. Modélisation des intéractions entre macromolécules IV.1 – Modélisation par remplacement moléculaire

95 Interaction protéine inhibiteur protéine : structure cristallo

97 + Inhibiteur homologue Enzyme

98 Minimisation d’énergie et étude de l’interaction

99 IV. 2 – Modélisation automatique
Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques Chapitre 4 – Intéractions entre macromolécules I. Interactions protéines – protéines II. Interactions protéines – acides nucléiques III. Interactions protéines – polysaccharides IV. Modélisation des intéractions entre macromolécules IV.1 – Modélisation par remplacement moléculaire IV. 2 – Modélisation automatique

100 Exemple : interaction protéines sucres

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103 Résultat de la prédiction

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