Séparation magnétique des plasmocytes

Présentation au sujet: "Séparation magnétique des plasmocytes"— Transcription de la présentation:

1 Séparation magnétique des plasmocytes
dans le cadre des myélomes multiples Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique Prolonger votre offre de soins, jour après jour

2 Sommaire Le Myélome Multiple : Définition
2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ? 3. La séparation magnétique : Principe 4. Les outils de séparation : Différents appareils

3 Plasmocytes immatures
1. Le Myélome Multiple Définition : prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments 3 stades (classification de Durie et Salmon) : Plasmocytes matures Stade I Plasmocytes immatures Cytoplasme important Stade II Plasmoblastes Formation d’agrégats Stade III

4 1. Le Myélome Multiple Incidence: Augmente avec l’âge
Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme Moyenne d’âge de 64 ans Signes cliniques: Lésions osseuses Hypercalcémie Anémie Insuffisance rénale… Diagnostic : Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

5 1. Le Myélome Multiple  sans anomalies de structure associées 
Anomalies cytogénétiques : Hyperdiploïdie : chromosomes : +3, +9, +15, +19… Hypodiploïdie t(4;14) Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17  sans anomalies de structure associées  Valeur pronostique permettant un traitement adapté Diagnostic et suivi : Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype  hyperdiploïdie Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible  anomalies fines comme t(4;14), del(13), del(17) ET

6 2. Pourquoi une purification des plasmocytes?
Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes  Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17

7 3. Séparation magnétique des plasmocytes
Plasmocytes = CD138+ Principe : 1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 2. Tri sur colonne magnétique 3. Création d’un champ magnétique 4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique 3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS - AutoMACS - AutoMACS Pro

8 3. Séparation magnétique des plasmocytes
VarioMACS et AutoMACS Réalisation d’un ficoll Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiques Création d’un champ magnétique Récupération de la fraction négative Cassure du champ magnétique Récupération fraction positive 1 3 4 6 7 5 Plasma Cellules mononuclées Ficoll Polynucléaires et globules rouges 2

9 3. Séparation magnétique des plasmocytes
VarioMACS et AutoMACS  Perte cellulaire dans le ficoll : - cellules de tailles différentes I II III - agrégations protéique et plasmocytaire  Colonnes et valves souvent saturées  Technique lourde (temps) Utilisation de l’AutoMACS Pro

10 3. Séparation magnétique des plasmocytes
AutoMACS Pro Sélection du programme Tri magnétique sur AutoMacs Pro 3 tubes : échantillon, fraction négative et positive Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive Après technique, 3 lames étalées : t(4;14),13 et 17 Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 1 3 4 2 5 6 7 8

11 3. Séparation magnétique des plasmocytes
AutoMACS Pro  Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés rendement augmenté (>86% : panel FISH complet)  Adaptation du programme de séparation pureté augmentée (<5% d’échec de purification)  Tampons plus agressifs et filtres 40 µm automate moins saturé, maintenance adaptée  Automatisation Gain de temps

12 CONCLUSION Séparation magnétique :
routine dans les bilans de myélome multiple si nécessaire préférée à la mise en culture support pour les études pangénomiques

13 Remerciements L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA
L’équipe de FISH, CERBA Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA MILTENYI

14 Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon

15 Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques
4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert t(4;14)(p13;q32) del(17)(p11) Bandes R del(13)(q14q21) Bandes G

16 Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole
Patient Bone Marrow (ml) Total WBC % Plasma cells slide Theoric Total plasma cells MicroBeads Control Purity by flow cytometry Obtened Total Labeled P cell Performance 07D 4.8 mL 3.3*10^6 c/mL 36% 50 µL 94,60% 5.3*10^5 60% 6.5*10^6 8,15% 07D 6.2 mL 5.8*10^6 c/mL 8% 93,4 5.6*10^5 72.7% 2.6*10^7 2,15% 07D 4.3 mL 4.1*10^6 c/mL 5% 68,40% 10.9*10^4 59.3% 1*10^7 1,10% 07D 5.8 mL 5.6*10^6 c/mL 4% 72,80% 1.7*10^5 1% 3.2*10^5 53,13% 07D 3 mL 4*10^6 c/mL 22% 88,40% 2.5*10^5 15% 1.8*10^6 13,90% 07D 5.3 mL 8.4*10^6 c/mL 0% 65,50% 5.2*10^4 2.2*10^6 2,36% 07D 2.7 mL 3*10^6 c/mL 88,70% 1.8*10^5 12% 9.7*10^5 19% 07D 6.1 mL 7.7*10^6 c/mL 3% 31% 7.4*10^4 4.7*10^5 15,70% 07D 6.8 mL 1.1*10^6 c/mL 54,10% 1.5*10^5 3.7*10^5 40,50% 07D 6.3 mL 1.6*10^7 c/mL 10^6 18,00% % of plasma cells reported by cytologist % and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38 1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138 Mauvais rendement : adaptation de la quantité d’Ac : 50µL Ac pour 107 cellules

17 Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation
Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean PosselWB+Clean = Meilleur rendement Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH