Le TP d'enzymo de M. Rodriguez.

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1 Le TP d'enzymo de M. Rodriguez.
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2 plan La réalisation des TP d'enzymologie s'organisent en trois étapes.
* Les précautions préalables. - la dilution éventuelle de l'enzyme. - la vérification du domaine de vitesse stationnaire si on utilise la méthode à deux points. * L'étalonnage. plan * La détermination des Vm et Km.

3 dil * Les précautions préalables.
La première étape est de vérifier si la concentration de l'enzyme (l'activité de la solution fournie) est compatible avec les conditions du dosage. * Les précautions préalables. Si l'enzyme est trop concentrée, l'absorbance des préparations dépasseront rapidement les capacité des appareils. dil -----> il faut alors la diluer puis vérifier que la dilution choisie est la bonne. Le spectro clignote à 2 au bout de 10 secondes ! Si l'enzyme n'est pas assez concentrée, les vitesses de réaction seront très faibles et les variations d'absorbances difficilement exploitables. -----> On ne peut rien faire pour la solution enzymatique. On tente de compenser cette faiblesse en utilisant des concentrations importantes de substrat. Sans garantie que ça marche. Il faut essayer. Retour au menu

4 dil * Les précautions préalables. En pratique:
On prépare le mélange réactionnel comme indiqué dans le protocole: - substrat - tampon - enzyme dil On passe au spectro et on guette l'absorbance. - en continue si c'est possible (b-gal) - au bout du temps d'incubation indiqué (invertase) On interprète les observations: on anticipe la réaction de l'enzyme en fonction des concentrations de substrat au cours de la manipulation. Retour au menu

5 dom-lin * Les précautions préalables.
Dans le cas d'un dosage à deux points, il faut vérifier que le temps d'incubation donné appartient au domaine de vitesse stationnaire. Ce domaine est l'intervalle de temps où la vitesse est constante (maximale à cette concentration de substrat), c'est à dire, que l'absorbance croit de façon linéaire. * Les précautions préalables. dom-lin On le met en évidence en effectuant une cinétique continue. vitesse stationnaire ralentissement On choisit le temps d'incubation dans cet intervalle. Retour au menu

6 dom-lin * Les précautions préalables. a = Absx – Abs0 = Abs = Vi
Dans le cas d’un dosage à deux points, on sait que la variation d'absorbance, à l'intérieur de ce domaine, suit une droite qui passe par l'origine et par le point expérimental. La pente de cette droite se calcule simplement grâce à l’équation: * Les précautions préalables. a = Absx – Abs0 = Abs = Vi t – t0 tincubation dom-lin vitesse stationnaire ralentissement On choisit le temps d'incubation dans cet intervalle. DAbs Retour au menu Dt

7 Je n’aurais pas l’outrecuidance d’expliquer à des BTK-2 le principe de l’étalonnage. En cas de doute soudain, je vous renvoie au TP 01. Je veux juste faire une remarque. En enzymo, on dose, le plus souvent, le produit de la réaction. Par conséquent, l’étalonnage se fait avec le produit, tandis que la gamme utilisé pour les cinétiques se fait avec le substrat. Ca parait évident comme ça, mais devant le charriot de matériel… * L'étalonnage. etal Etalonnage ONP cinétiques ONPG Retour au menu

8 où a est le coefficient directeur de la droite.
* L'étalonnage. Il est possible de calculer e après l’étalonnage. Ce calcul ne présente aucun intérêt pratique car tous les calculs sont effectuer avec l’équation de la droite. Mais si cette valeur est demandée, on est obligé de la calculer. Revenons aux fondamentaux, c’est-à-dire l’équation de Berr-Lambert. A = e.C.l etal epsilon Soyons clair ! Il est hors de question d’utiliser les valeurs d’un point pris au hasard dans la droite étalon pour effectuer le calcul. Premièrement parce que ce n’est pas fun. Deuxièmement parce que les points sont entachés d’incertitude. C’est pour cela que l’on utilise une gamme. On connait l’équation de la droite*: A = a.C où a est le coefficient directeur de la droite. *Je considère le cas simple de la droite passant pas zéro. Retour au menu

9 etal epsilon * L'étalonnage. A = e.C.l A = a.C
Ce n’est vrai qu’à une condition: les concentrations considérées utilisent la même unité, en l’occurrence les mol.L-1 ! d’où e.= a / l A = e.C.l puisque l = 1 (cm) donc e = a etal epsilon Sinon: * on calcule les concentrations de la gamme en mol.L-1 et on retrace la droite étalon. Abs A = a.C a = e en L.mol-1.cm-1 Retour au menu C en mol.L-1

10 etal epsilon * L'étalonnage. A = e.C.l A = a.C
Ce n’est vrai qu’à une condition: les concentrations considérées utilisent la même unité, en l’occurrence les mol.L-1 ! A = e.C.l d’où e.= a / l A = a.C avec l = 1 (cm) donc e = a etal epsilon Sinon: * on extrapole la valeur de a en mol.L-1. -----> Ce n’est pas une conversion comme pour la gamme. L’avantage, c’est que l’on manipule des valeur « présentables » sans décimales. Marche à suivre. L’absorbance théorique d’une solution à 1 mol.L-1 est égale à 106 absorbance de la même solution qui serait à 1 µmol.L-1. Retour au menu -----> En pratique, c’est évidemment faux à cause du domaine de linéarité de la méthode.

11 etal epsilon * L'étalonnage. A mol.L-1= e.C.l A lue = a.C
d’où e = a . 106 A mol.L-1= e.C.l en mol.L-1 A lue = a.C A théo = a x C avec l = 1 (cm) donc e = a en µmol.L-1 en mol.L-1 etal epsilon Sinon: * on extrapole la valeur de a en mol.L-1. -----> Ce n’est pas une conversion comme pour la gamme. L’avantage, c’est que l’on manipule des valeur « présentables » sans décimales. Marche à suivre. L’absorbance théorique d’une solution à 1 mol.L-1 est égale à 106 absorbance de la même solution qui serait à 1 µmol.L-1. a = e en L.mol-1.cm-1 Retour au menu -----> En pratique, c’est évidemment faux à cause du domaine de linéarité de la méthode.

12 VM/Km * La détermination des Vm et Km.
En tout premier lieu, tracer la courbe de Michaëlis pour vérifier que l’enzyme possède bien un comportement michaëlienne. Vi [ S ] VM/Km * La détermination des Vm et Km. -----> C’est une vérification personnelle. Il n’est pas forcément besoin de joindre la courbe au compte-rendu. Par contre, il faut signaler qu’elle a été faite. Retour au menu

13 Vm/Km * La détermination des Vm et Km. 1/Vi = a . (1/S) + b Vm = 1 / b
Après traçage du double inverse, déterminer s’il est nécessaire d’écarter des points. Les moins fiables sont les points de droite (1/C grand) car ils possèdent les % de certitude les plus faibles. 1/Vi [ 1/S ] Vm/Km 1/Vi = a . (1/S) + b Vm = 1 / b Km = a / b Retour au menu -----> Attention, comme toute règle, elle n’est pas systématique.