Méthodologie de recherche des 5 EHEC Typiques majeurs en méthode de routine Steakexpert, le 22 juin 2011.

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1 Méthodologie de recherche des 5 EHEC Typiques majeurs en méthode de routine
Steakexpert, le 22 juin 2011

2 Méthode de recherche des EHEC Typiques majeurs: retour d’expérience
Méthode de détection des E.coli EHEC Typiques majeurs Eléments de choix Le mode opératoire Les délais analytiques Le screening négatif Les confirmations Eléments de maîtrise de la prestation analytique Le respect des délais analytiques Prise en compte de la variabilité du volume analytique Garantir la fiabilité des résultats Les témoins quotidiens de Recherche Concordance SIlliker/CNR E. Coli STEC Perspectives 2

3 Eléments de choix de la méthode
Disposer d’une méthode reconnue Mode opératoire reposant sur le projet de norme ISO/TS 13136 Disposer d’un screening rapide des échantillons négatifs pour libérer les lots Disposer rapidement de résultats fiables sur colonies susceptibles de déclencher la procédure d’alerte pour éviter les retraits

4 Mode opératoire selon Projet de norme ISO/TS 13136
25 g d’échantillons dilués au 1:10 dans bouillon EPT Incubation à 41,5°C pendant 8-12H (J0-18H) Extraction de l’ADN présent dans le bouillon d’enrichissement (J1) PCR pour détection des gènes stx (stx1 et stx2), eae et O157 (J1) Si eae et/ou stx négatifs: absence de STEC pathogène (J1-12H) Si eae et stx positifs, PCR pour identification des sérovars O157:H7, O26, O111, O145 et O103 (J1) Si tous les sérovars sont négatifs : Absence STEC pathogène (J1-16H) Si un des sérovars est positif Enrichissement du bouillon d’enrichissement par immunoconcentration (J1) Méthode pour détecter les 5 STEC (O157:H7, O26, O111, O145, O103). Réalisée à CERGY uniquement. 4

5 Mode opératoire selon Projet de norme ISO/TS 13136
Isolement sur gélose spécifique du sérovar (J1) Incubation 37°C x h (J1) Sélection au maximum de 50 colonies caractéristiques (J2) PCR pour détection des gènes stx, eae et E. coli O157 sur les 50 colonies (J2) Si eae et/ou stx négatifs: absence de STEC pathogène (J2-17H) Si eae et stx positifs, PCR pour identification des sérovars O157:H7, O26, O111, O145 et O103 (J3) Si tous les sérovars sont négatifs : Absence STEC pathogène (J3-12H) Si un des sérovars est positif (J3) Confirmation biochimique (J4) Envoi des souches STEC au CNR pour confirmation (J+5-17H) Méthode pour détecter les 5 STEC (O157:H7, O26, O111, O145, O103). Réalisée à CERGY uniquement. 5

6 Méthode Genecycler (Genesystems)
Méthode Genecycler (Pall-Genesystems) Disques de 6 / 12 chambres réactionnelles 1 disque O157, stx1, stx2 et eae (et Salmonella) 1 disque H7, O26, O111, O103, O145 Méthode pour détecter les 5 STEC (O157:H7, O26, O111, O145, O103). Réalisée à CERGY uniquement. 6

7 Eléments de maîtrise de la prestation analytique
Respect des délais analytiques Fiabilité des résultats

8 Le respect des délais analytiques
Pouvoir s’affranchir de la variabilité du volume analytique Les causes: -Variabilité du nombre d’échantillons réceptionnés -Variabilité du % de confirmation à réaliser (re-test sur colonies isolées) _Augmentation de l’échantillonnage (3 fois n=30) en cas de positif confirmé Les moyens d’action: -disposer d’un pool d’équipement suffisant -disposer d’un nombre de technicien qualifié important avec contrainte de flexibilité (horaire, activité)

9 La fiabilité des résultats
Témoins quotidiens de recherche (validation du process analytique) Concordance Silliker Cergy/Centre National de Référence sur colonies isolées

10 Témoin Quotidien de Recherche
Matrice artificiellement contaminée avec pellets calibrés de O157:H7 (matériaux de référence calibrés avec souches connues et repérables à une concentration d’environ 4 UFC/25g) Validation de l’ensemble des étapes critiques: -enrichissement -extraction -amplification -détection -immuno-concentration

11 Concordance Silliker Cergy / CNR: validation de la technique PCR
Bilan sur les 4 derniers mois: Nb colonies isolées à Cergy envoyées au CNR pour confirmation: 72 Répartition: O26: 71 % O157: 24 % O103: 4 % Concordance: 97,3 % Nature des discordances: Résultats concordants entre Silliker et le Centre National de Référence

12 Perspectives Amélioration de la technique de screening Les attentes
Introduction de facteurs de screening complémentaires: gène nleB, variants eae associés au sérogroupes Les attentes Augmenter le % de lot libéré à l’issue de la 1ère étape de screening Baisser le nombre de confirmation sur les colonies isolées

13 Merci de votre attention
Votre interlocuteur Joël CROCIANI Expert Microbiologie Tél. : (0) Port : + 33 (0)  : SILLIKER France Pour de plus amples informations Merci de contacter le  : *  : Web : * 0.12€ TTC la min à partir d’un poste fixe