Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004

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1 Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004
Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004

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3 Principes généraux échantillonnage du prélèvement, fixation,
deshydratation, inclusion (paraffine, résine), coupe, colorations, observation.

4 I- Les coupes histologiques
3 à 5 µm d’épaisseur, quelques centimètres de largeur et longueur, nombreuses colorations possibles, montées entre lame et lamelle, grandissement de 10 à 1000 fois (environ).

5 Techniques de fixation
Immersion dans le fixateur la technique la plus utilisée (routine). Perfusion intravasculaire ou intraluminale très bonne fixation, délicate à mettre en place, pour la recherche.

6 Fixation Elle doit : préserver les structures tissulaires et cellulaires, éviter les artefacts (gonflements, rétractions), être rapide, permettre des colorations topographiques, permettre l’immunohistologie, être peu ou pas toxique.

7 Il n’y a pas de fixateur idéal
Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients. Parmi des centaines disponibles !

8 le formol seul (formaldéhyde dilué) dans l’eau courante, ou tamponné
bon marché, incolore, permet la fixation de grosses pièces, permet l’immunohistologie MAIS allergisant, carcinogène.

9 Les fixateurs contenant du formol (1)
AFA (Acide acétique Formol Alcool) très rapide (risques de surfixation), permet les marquages immunohistologiques. MAIS peu pénétrant. idéal pour les biopsies

10 Les fixateurs contenant du formol (2)
Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique) rapide, pénétrant, légères rétractions tissulaires, très belles colorations topographiques, MAIS ne permet que difficilement l’immunohistologie, coloré : tache ! (et ne part qu’avec l’épiderme). Idéal pour voir des gg. lymphatiques dans le tissu adipeux

11 Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être échantillonné et la taille des échantillons adaptée à celle de la cassette d’inclusion.

12 Deshydratation L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine.
Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux. On procède donc par étapes en remplaçant : l’eau par un alcool, l’alcool par un solvant organique, le solvant par la paraffine

13 Deshydration et Inclusion : l’automate
les bacs contiennent des alcools (5 bains), des solvants organiques (5 bains), de la paraffine chaude (3 bains). Remarque : machine historique ! Elle a 40 ans et fonctionne toujours !

14 Confection du bloc : Enrobage

15 Un moule est rempli de paraffine liquide

16 Le prélèvement est mis en place et le bloc mis à refroidir

17 Démoulage, après refroidissement

18 Mise en place du bloc sur le microtome

19 Confection des coupes : le ruban

20 Etalement sur lame

21 Séchage avant coloration

22 Les colorations sont infinies
Les colorations sont infinies. Ne vous fiez pas à la couleur pour « reconnaître » une structure !

23 Observations, photographies.

24 Résultat surprise Poumon de chien

25 Et n’oubliez pas …. De remettre vos lames dans les boîtes, vous nous aiderez !

26 Microscopie électronique
Quelques millimètres de largeur et longueur, 60 à 100 nanomètres d’épaisseur, coupe déposée sur une grille métallique, rares colorations possibles, grandissement de 1000 à fois.

27 Les blocs environ 2 mm3 de tissu,
fixation immédiate glutaraldéhyde / tétroxyde d’osmium, inclusion en résine, imprégnation par métaux lourds (plomb).

28 Coupe (dégrossissage au couteau de verre)

29 Coupe ultra-fine (couteau diamant)

30 Les coupes sur grille métallique

31 Le (vénérable) microscope électronique de la fac’

32 Mise en place de la grille

33 Observation

34 Mise au point, observation

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36 En microscopie optique, les plus forts grandissements sont :
X 400 X 1 000

37 En microscopie électronique, le plus fort grossissement est x 100 000.
Les plus couramment utilisés sont entre x et x X