Méthodes de caractérisation  IV- Absorption Infra-Rouge  Radiations correspondant à des transitions entre des états de vibration de la molécule (exemple.

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1 Méthodes de caractérisation  IV- Absorption Infra-Rouge  Radiations correspondant à des transitions entre des états de vibration de la molécule (exemple d’un CH 2 ) EtirementsymétriqueEtirementAnti-symétrique Cisaillement BasculeAgitation Torsion 1

2 Méthodes de caractérisation  IV- Absorption Infra-Rouge  Molécules diatomiques n'ont qu'une seule liaison qui peut être étirée  Molécules plus complexes possèdent plusieurs liaisons: Les vibrations peuvent être conjuguées et conduire à des absorptions infrarouges spécifiques  On détermine les raies d’absorption en mesurant la transmission du faisceau électromagnétique en fonction du nombre d’onde entre 650 et 4000 cm -1 Fréquences caractéristiques liées à des fonctions chimiques 2

3 3 radiation infrarougevariation énergie vibrationnelle molécule apparition d’une bande dans le spectre Mise en résonance des fréquences de vibration des liaisons dans un groupement fonctionnel pic typique

4 4 La spectroscopie infrarouge est une méthode d’identification et de dosage non destructive Un spectre infrarouge donne information: sur la présence de certains groupements fonctionnels sur la structure d’une molécule (si on connait la formule brute) mais d’autres analyses sont nécessaires pour confirmer la structure d’un analyte

5 5 Interprétation spectre IR: 1.d’abord repérer ou exclure présence pics caractéristiques 2.regarder région gauche des groupements fonctionnels 3.ne pas détailler la région droite des empreintes digitales 4.considérer intensité, largeur, nombre d’onde des pics pour l’attribution 5.suivre raisonnement logique pour déterminer structure moléculaire Rappel: un pic est du à la variation de l’élongation: stretching ( ) ou aux déformations dans et hors du plan: bending (  )

6 Méthodes de caractérisation  IV- Absorption Infra-Rouge  Appareillage  Applications: Analyse fonctionnelle (caractérisation de composés) Contrôles pollution véhicules motorisés (bandes CO 2 et CO) Traitement des données Chambre Echantillon Interféromètre 6

7 7 7 Préparation de l’échantillon 1.solide ou liquide en solution dans une cellule ou cellule cylindrique pour composés gazeux 2. gouttelette de liquide entre pastilles de NaCl = film (possibilité utilisation solvant anhydre ou dispersion échantillon dans huile peu absorbante en infrarouge = nujol, huile de paraffine)

8 8 3. solide dans des pastilles de KBr mortier moule presse à pastiller pastille de KBr + échantillon

9 9 Avant chaque mesure IR on fait le « background »: on fait le spectre de l’air, qui est mémorisé par l’appareil et soustrait au spectre de l’échantillon Raison: éliminer les pics donnés par les molécules présents dans l’air, (notamment CO 2 )

10 10 Exemple de l’interférence de la CO 2 dans les spectres IR

11 11 Position de la bande (cm -1 ) Mode de la vibration Liaison concernée largeurintensité 3300 ν O-Hlargeintense 2900 ν C-H (CH 3 )étroiteintense 2000 ν C=C arométroitepeu intense 1100δC-Oétroiteintense exemple présentation données spectre IR Même chose pour écrire le spectre théorique d’un composé

12 12 une des techniques analytiques les plus utilisées en chimie organique et biologique pour l’identification des composés donne une information sur la structure d’une molécule (+ par rapport aux spectres IR, UV-vis, etc.) a une application très importante dans le domaine médicale (IRM) La RMN en trois points

13 13 échantillon Instrument = Spectromètre RMN Résultat analyse = spectre RMN Information obtenue = « position des atomes d’hydrogène dans une molécule» et déduction de la structure Spectre RMN

14 14 Quelles infos nous donne un spectre 1 H-RMN La présence d’atomes d’hydrogène en différentes environnements dans une molécule donne lieu à plusieurs signales (massifs) dans le spectre 1.La POSITION d’un signal nous dit quel type de protons est à l’origine 2.L’ AIRE d’un signal nous dit combien de protons il y a pour chaque type 3.La MULTIPLICITE du signal nous fait connaître la relation entre protons (combien de protons il y a à côté du proton qui donne le signal)

15 Méthodes de caractérisation  V- Résonance magnétique nucléaire (RMN)  Technique d’analyse chimique et structurale non destructive très utilisée en physique (études de matériaux), chimie ou biochimie (structure des molécules) et pour l'imagerie médicale (IRM) spin  Technique de spectroscopie concernant les noyaux possédant un spin nucléaire différent de zéro nucléaire différent de zéro  Le noyau est considéré comme une sphère chargée ayant un mouvement de rotation autour d’un axe: Le noyau est assimilé à un petit aimant caractérisé par son moment magnétique (quantifiable) Sous l’action d’un champ magnétique extérieur les noyaux vont s’orienter parallèlement à ce champ  Une autre impulsion électromagnétique provoque le passage des noyaux du niveau fondamental vers un état excité Résonance Magnétique Nucléaire 15

16 Méthodes de caractérisation  V- Résonance magnétique nucléaire (RMN)  L’effet de l’impulsion électromagnétique au niveau du noyau des atomes dépend de l’environnement électronique qui entoure ces noyaux  Entre noyaux voisins existent des interactions (couplage spin-spin) Notion de déplacement chimique Notion de multiplicité du signal 16

17 17 δ = 2.7 Quelques exemples de spectre: bromure de méthyle On appelle le signal singlet car il est constitué par une seule ligne

18 18 Acétate de méthyle δ 2.1δ 3.7

19 19 Chaque pic du spectre RMN (pic) est proportionnel au nombre d’hydrogènes qui sont responsables du signal  l’aire de chaque pic est proportionnelle au nombre de protons équivalents qui donnent le pic Intégration 8 7 6 5 4 3 2 1 0 exemple Intégration: 2H 3H L’intégration peut correspondre à CH 2 CH 3 mais aussi à 2CH 2 2CH 3

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21 21 Intégration= n° protons δ = déplacement chimique en ppm Exemple de spectre RMN d’une molécule organique Courbe d’intégration = aire du pic Abscisses: δ,déplacements chimiques, en ppm (gamme: 14 - 0) impureté Ligne de base 1.99000.2120 1.00001.2465 3.6628 1.1476 3.0860 0.8916 2.25070.9747 7.1797 5.2803 4.1625 2.3483 1.99421.92771.6789 1.39411.1876 0.8529 0.4101 0.0677 (ppm) 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0

22 Méthodes de caractérisation  V- Résonance magnétique nucléaire (RMN)  Noyaux concernés: 1 H, 13 C, 31 P, 19 F, 15 N, 17 O,…  Applications: Analyses qualitatives Analyses quantitatives Détermination de la structure Détermination de la géométrie et/ou stéréochimie 22

23 23  spectre RMN normalement est fait en solution  3-20 mg échantillon solide  un solvant deutéré est requis (environ 300 µl)  solvants plus communs :CDCl 3, D 2 O, d 6 -DMSO, CD 3 OD  La solution est placée dans un tube RMN  Le tube est introduit dans le spectromètre Comment on fait un spectre RMN

24 Méthodes de caractérisation  V- Résonance magnétique nucléaire (RMN)  Appareillage 24

25 Méthodes de caractérisation  VI- Spectrométrie de masse  Méthode destructive permettant à la fois d'accéder à la mesure de la masse moléculaire d'une substance ainsi que d'obtenir des données substance ionisée structurales: la substance ionisée se trouve dans un état excité qui fragmentation provoque sa fragmentation  Chacun des ions formés est caractérisé par son rapport masse/charge séparés détectés (m/z). Les ions sont séparés selon ce rapport m/z puis détectés  Champ d'application classiquement limité à l'étude des petites molécules organiques (M < 2.000), mais actuellement possibilité d'étudier des macromolécules (M > 100.000), dont il est possible de déterminer la Masse Molaire à une unité près! coupléschromatographie  Appareils souvent couplés avec un système de chromatographie (CPG ou HPLC, SFC,…) L'analyse de ces fragments informe sur la structure de la molécule 25

26 26 Spectrométrie de masse Différence avec les autres méthodes spectroscopiques: pas de radiation incidente absorbée par l’échantillon mais ionisation de la substance les plus souvent par IMPACT ELECTRONIQUE (EI) M ----- → M +  + e molécule → ion moléculaire (cation radical) Faisceau électrons Faisceau électrons

27 Méthodes de caractérisation  VI- Spectrométrie de masse  Appareillage: Analyseur 27

28 28 Exemple de spectre de masse: décane Abscisse: Ordonnée: intensité relative (%) 43 = Pic base = pic plus intense pris comme 100 % Ion moléculaire ou pic parent écart entre les pics (14 = CH 2 )

29 29 Applications spectrométrie de masse 1) Chimie organique -Synthèse organique: détermination masse molaire → confirmation structure molécule synthétisée - spectre d’un composé inconnu: - évaluation masse molaire - étude fragmentations: renseignements sur la structure - comparaison spectre littérature pour identification (bases de données) Un development recent: TLC - MALDI Possibilité de faire une chromatographie sur couche mince sur une plaque spéciale qui est introduite dans le spectromètre spectre de masse de chaque tache

30 30 2) Chimie analytique - Laboratoire d’analyse médico-légal, détermination traces de substance - Contrôle qualité, détection fraudes, détection pollution environnementale - Possible identifier rapidement nombreuses substances grâce à bases de données

31 31 Exemple Spectre ESI de de la protéine lysozyme de l’œuf de poule Les pics correspondent à la protéine entière + un numéro variable de protons 3) Biologie - Détermination masse molaire protéines, enzymes, molécules biologiques - Elucidation séquence acides aminés - Suivi réactions enzymatiques - Identification molécules à partir d’extraits végétales /animales = outil puissant pour évaluer la présence de composés exploitables dans extraits d’origine naturelle - Aide à la compréhension fonctionnement enzymes, liaison au substrat, interactions entre les protéines

32 32 Technique MALDI-TOF = spectre de masse des macromolécules = Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation – Time Of Fligth spectrométrie de masse appliqué aux molécules de grosse taille comme les polymères ou les protéines: permets la détermination de la masse molaire des chaînes principe L’outil biotyper permet d’analyser directement les bactéries pour les identifier (identification protéines spécifiques)

33 33 Exemple : spectre MALDI d’un polypeptide Détermination séquence acides aminés possible Keough T et al. PNAS 1999;96:7131-7136

34 34 Gaz chromatographie-spectrométrie de masse (GC-SM) 1) injection échantillon dans le gaz chromatographe 2)séparation des composés dans la colonne 3) analyse composés dans un détecteur non destructif 4)arrivée différée des composés dans la chambre de ionisation 5)spectre de masse de chaque composé L’analyse donne 2 résultats: 1)séparation constituants mélange 2)Identification (calcul masse molaire, structure)

35 35 VII- Fluorescence Moléculaire Principe Méthodes de caractérisation Source radiation = UV-visible Effet = transitions des électrons entre les niveaux énergétiques grâce à l’énergie absorbée On peut mesurer 1)Longueur d’onde + intensité absorption = spectre absorbance (ou excitation) 2)Longueur d’onde + intensité émission = spectre émission

36 36 Notion de rendement quantique Φ = nombre molécules flourescentes/ nombre total molécules excitées Φ max = 1 (=nombre photons emis = nombre photons absorbés)

37 37 Spectrofluorimètre Ou laser

38 38 Exemple de spectre de fluorescence intensité fluorescence proportionnelle concentration → possibilité mesures quantitatives

39 39 Principe fonctionnement microscope à fluorescence Radiation envoyée sur l’échantillon Radiation émise InfraRougeUV 400 700 Applications dans l’imagerie Bactéries marquéesCellules contenants marqueur fluorescent

40 40  Molécules fluorescentes  Les composés qui contiennent des noyaux aromatiques produisent l’émission fluorescente moléculaire la plus intense et donc la plus utilisée.  Certains composés carbonylés aliphatiques et acycliques, ainsi que des structures à nombreux double liens conjugués sont aussi fluorescents (mais moins nombreux).  Fluorophores des biomolécules: Tryptophane (groupement aromatique) absorbe à 280 nm, émet autour de 340 nm Fonction SH des cystéines Fonction NH 2 de la lysine Identification des intercalants de l’ADN 40

41 41 The end