Technique de purification des protéines : Electrophorèse.

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1 Ben Hamed Hajer Technique de purification des protéines : Electrophorèse

2 Plan 1) introduction 2)Définition 3)Principe de L’électrophorèse 4)Les différentes types de l’ électrophorèse : Électrophorèse sur papier Électrophorèse non dénaturante sur gel Électrophorèse en SDS-page Electrophorèse sur gradient de ph 5) Visualisation 6)Les application de l électrophorèse

3 introduction Les techniques d’étude et d’analyse d’une protéine nécessite d’ abords son extraction et sa purification. Ceci peut donc apparaître comme un problème difficile pour 2 raisons : Elle n’existe qu’à très faible concentration Elle est mélangée à des millier d’autres protéines

4 Solution : Tirer profit des différences de propriétés physicochimiques et biochimiques des protéines: solubilité, taille point isoélectrique, charge hydrophobicité affinité pour certains ligands Purification des protéines

5 L’électrophorèse L'électrophorèse est une technique permettant la séparation de molécules porteuses de charges électriques comme les acides aminés, les protéines, les acides nucléiques dont l'ADN.. L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892.

6 Principe les molécules à séparer sont placées dans un champ électrique créé par une tension continue. Les molécules chargées négativement se déplacent vers le pôle positif (= l'anode) et celles qui sont chargées positivement se déplacent vers le pôle négatif (= la cathode). La vitesse de migration des constituants chimiques dépend de leur charge électrique totale et de leur masse moléculaire.

7 Les types d’électrophorèse Electrophorèse libre ( en veine liquide ) L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones est réalisée dans un tube en U de section carrée(ceci afin de pouvoir réaliser des mesures optiques au travers du tube, comme avec une cuve de spectrophotomètre) permet de stabiliser la phase liquide grâce à l’utilisation d’un support poreux imprégné d'un solvant tamponné. 2 types de montage peuvent être mis en place: soit horizontale soit verticale

8 L'électrophorèse en veine liquide. Vs L'électrophorèse de zone. L'électrophorèse en veine liquide. L'électrophorèse de zone Avantages : Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques. Inconvénients : Appareillage couteux. La mise en oeuvre et longue et délicate. Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines. Avantages : Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles. La taille des mailles pour les supports en gel influencent la vitesse de migration Inconvénients : appareillage coûteux La mise en œuvre longue et délicate elle ne permet pas de distinguer, d'isoler, ni de caractériser les fractions protéiques autrement que par leur mobilité

9 la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée est celle de l’électrophorèse en zones

10 Électrophorèse sur papier papier filtre ou acétate de cellulose Habituellement employé dans un montage horizontal il servait surtout à séparer des acides aminés ou d'autres petites molécules chargées. Le dépôt et la migration des échantillons se font en surface Exemple :

11 Électrophorèse sur gel constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à utiliser dans la séparation des macromolécules - les gels d’usage commun, l’agarose et le poly acrylamide, possèdent des pores de la taille des protéines à séparer - la séparation moléculaire est basée non seulement sur la mobilité électrophorètique des molécules, mais aussi sur le principe de filtration sur gel - les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grandes par rapport aux molécules plus petites

12 1) Électrophorèse en gel de poly acrylamide aussi appelé PAGE (pour PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), - les gels sont fabriqués à partir d’une polymérisation radicalaire d’acrylamide et N,N- méthylènebisacrylamide dans un tampon

13 Gel de poly acrylamide Les échantillons sont déposés dans des puits préformés au sommet du gel le tampon est le même dans les réservoirs du haut et du bas un courant continu de 100 à 200 volts parcourt le gel pendant la durée de migration les protéines migreront vers l’anode (+) selon leur charge/masse après migration, le gel est retiré et les bandes de protéine sont visualisées dans ce type de gel, plus le gel est long, meilleure plus la résolution est bonne

14 2) Gel SDS-PAGE - la méthode la plus répandue parmi les techniques biochimiques afin de déterminer la pureté d’une protéine cette technique dépend du fait que certains savons ou détergents, sont capables de dénaturer la structure d’une protéine - le sodium dodecyl sulfate (SDS) représente un des détergents les plus puissants à cet égard (formule chimique du SDS: [CH3 - (CH2)10 – CH2 – O – SO3-]Na+ )

15 la forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge intrinsèque des protéines Les protéines sont chargés négativement,de forme allongés, elles migrent vers l’anodes en fonction de leur PM

16 Sds page - cette méthode possède deux grands avantages par rapport à l’électrophorèse ordinaire - 1) l’utilisation de SDS dissous les agrégats et les particules insolubles qui peuvent -causer des problèmes en bloquant les pores du gel 2) la mobilité électrophorétique possède une relation directe avec le poids moléculaire

17 Electrophorese en pH discontinue 1) Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing) La migration est effectuée dans un gradient de pH qui peut etre generé en ajoutant des ampholytes avec un gel d’acrylamide, c’est un mélange d’espaces amphotères avec une gamme de valeur PI Proprietes des ampholytes : Meme conductivité Grande cappacité d’effet tampon Soluble à son propre point isoélectrique Intéraction minimale avec les proteines électrofocalisés

18 Dans cet exemple, l'échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre du gel. Évidemment, peu importe où l'échantillon est déposé puisque les protéines migreront dans une direction ou dans l'autre jusqu'à ce qu'elles rencontrent leur point isoélectrique, point où elles cessent de migrer.

19 L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir une courbe de titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). On prépare un gel dans lequel on établit le gradient de pH, puis on dépose dans une rigole centrale la solution de protéine, après quoi on tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer un courant électrique.

20 Visualisation des protéines dans les gels - une fois que la migration des protéines dans le gel est terminée, il faut visualiser les bandes obtenues par les protéines - les différentes approches sont: 1)la coloration avec le bleu de Coomassie brillant

21 Application 2) la coloration au nitrate d’argent

22 3) autoradiographie : si les protéines sont marquées avec un isotope radioactif comme le S35 ou le C14

23 Applications électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques et nucléotides. Elle permet dans certaines conditions (emploi de micelles de détergents ioniques) de séparer des molécules non ioniques, comme des hormones stéroïdes par exemple. Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose Immunoélectrophorèse :La révélation est basée sur une réaction "antigène-anticorps« Séparation les molécules d’adn

24 bibliographie http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/electropho rese/E2.html http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/electropho rese/E2.html http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrook e.ca/5b1.html https://www.webdepot.umontreal.ca/Usagers/.../3- Electrophorèse.pdf http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrook e.ca/5b1.html https://www.webdepot.umontreal.ca/Usagers/.../3- Electrophorèse.pdf http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro phorese.pdf http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro phorese.pdf http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro phorese.pdf http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro phorese.pdf

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