Présenté par: HOUESSE Arnaud Michée Etudiant en MasterII à l’Université de Parakou Thème Parakou le 07 Décembre 2016 Evaluation du potentiel des nématodes.

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1 Présenté par: HOUESSE Arnaud Michée Etudiant en MasterII à l’Université de Parakou Thème Parakou le 07 Décembre 2016 Evaluation du potentiel des nématodes entomopathogènes du Bénin à lutter contre le charançon de la patate douce Cylas puncticollis (Boheman) en conditions de laboratoire 3 ème colloque scientifique de l’Université de Parakou, du 7 au 9 Décembre 2016

2 Plan  Introduction  Objectifs de l’étude  Matériel et Méthodes  Résultats et discussion  Conclusion

3 Introduction 1/2  Actuellement, 217, 8 millions de personnes soit 25%, de la population subsaharienne sont sous alimentés (FAO, 2015).  La patate douce fournit plus de calories par unité de surface que toute culture (Mehm et Espig, 1991).  Importante source de Vitamines C, A et de fibres alimentaires (Stathers et al., 2013).  Les ravageurs les plus désastreux pour la patate douce en Afrique sont Cylas puncticollis et C. brunneus (Andrade et al., 2009) Sécurité alimentaire et nutritionnelle

4 Introduction 2/2  Le plus important parmi ces deux charançons est C. puncticollis (Boherman), qui peut détruire 73 à 100% de la récolte (Mohamed., 2005).  Une des méthodes de lutte NEPs Photo 1: Tubercule de patate douce infesté par Cylas puncticollis (A), Tige de patate douce détruite par Cylas puncticollis (B) Source: Stathers (2013) et Kotchofa (2016) A B

5 Objectif de l’étude 1/1 Proposer aux producteurs du Bénin une méthode de lutte biologique, efficace, saine et durable contre C. puncticollis en utilisant les nématodes entomopathogènes du Bénin. OG OS1 Evaluer l’habileté des NEPs à se déplacer et à pénétrer C. puncticollis; OS2 Effets des NEPs sur la mortalité des larves, des pupes et des adultes de C. puncticollis OS3 Evaluer le potentiel de reproduction des NEPs.

6 Matériel et méthode 1/6  Matériels  Cinq isolats de NEPs dont deux (02) Heterorhabditis sonorensis (Ze4; Hessa2); et un (01) Steinernema (Bembereke Steinernema sp) Dangbo et Korobororou; Larves ♀ ♂ Pupes Adultes Photo 2: Les trois stades de développement de Cylas puncticollis, utilisés dans les essais. Source: M. A. Houesse (2016)

7 Matériel et méthode 2/6  Méthodes 1- Aptitude des nématodes entomopathogènes à la pénétration Exposition de chaque insecte à 200 (LI) de NEPs pendant 2, 4, 6, 8, 10 et 12 h. Inoculation des NEPs dans les boîtes de Petri et insertion de l’insecte au milieu de la boîte de Petri Photo 3: Manipulation au laboratoire Source: M. A. Houesse (2016)

8 Matériel et méthode 3/6 2- Effet de différentes concentrations de nématodes entomopathogènes sur la mortalité des larves, des pupes et des adultes de Cylas puncticollis  Pour un isolat donné, quatre concentrations ont été utilisées (1; 5; 20; 40 nématodes /60µl d’eau stérilisée) pour un insecte. insecte 3/4 Sable stérilisé (80°C, 72 h) humidifié à 14% (v/v) (Zadji et al,. 2014)  Pas de NEPs pour le traitement témoin;  Chaque traitement a été répété 4 fois avec 10 tubes Eppendorfs par traitement;  Incubation (48heures) à 27±1° et évaluation du Taux de mortalité,  Dissection (grossi: 20X) pour confirmation du parasitisme Photo 4: Manipulation au laboratoire Source: M. A. Houesse (2016)

9 Matériel et méthode 4/6 3- Potentiel de reproduction des nématodes entomopathogènes  Les insectes exposés à 20 nématodes chacun, dans l’expérience précédente ont servi après leur mort (48heures après inoculation) à l’évaluation du potentiel de reproduction des nématodes en leur sein;  Poids des insectes larve=13,57mg : pupe= 11,07mg ; adulte=7,05mg  Dissection de la moitié des insectes pour chaque stade sous binoculaire (20X)

10 Matériel et méthode 5/6 3- Potentiel de reproduction des nématodes entomopathogènes  Les insectes de l’autre moitié sont individuellement rincés puis transférés sur White trap et (27±1°C);  Contrôle des White trap chaque jour Jour de la première émergence  Toutes les LI de nématodes ayant émergés de chaque insecte sont comptés 7 jrs après la date de première émergence. Photo 4: Manipulation au laboratoire Source: M. A. Houesse (2016)

11 Matériel et méthode 6/6

12 Résultats et discussion 1/11 1-Aptitude des nématodes entomopathogènes à la pénétration Figure 1: Evolution des taux de pénétration pour chaque isolat en fonction du temps

13 Résultats et discussion 2/11  Les Heterorhabditis sont en général reconnus comme des ‘’cruisers’’ tandis que les Steinernema se comportent comme des ‘’ambuscadeurs’’ (Schroeder et Beavers, 1987; Mauléon et al., 2006;).  Les travaux de Zadji et al. (2014) ont montré une stratégie de recherche de type ‘’cruisers’’ chez Heterorhabditis sonorensis (Ze4; Hessa2) Tableau 1: Taux de pénétration des nématodes entomopathogènes dans les larves et les pupes de Cylas puncticollis

14 Résultats et discussion 3/11 Figure 2: Anatomie comparée des larves infestantes d’Heterorhabditis et de Steinernema Source: Mauléon et al. (2006) Dent céphalique

15 Résultats et discussion 4/11 Source de variationFDfP Concentrations13,163,180<0,0001*** Isolats33,354,180<0,0001*** Stades68,892,180<0,0001*** Concentration*Isolat5,2612,180<0,0001*** Concentrations*Stade1,996,1800,0688 Isolat*stade2,078,1800,0407 Isolat*Stade*Concentration0,8324,1800,6904 2- Effet de différentes concentrations de nématodes entomopathogènes sur la mortalité des larves, des pupes et des adultes de Cylas puncticollis  C. puncticollis est sensible aux NEPs testés, quelque soit son stade (Nderitu et al., 2009 et Totin et al., 20014).  Le taux de mortalité des larves, pupes et adultes de C. puncticollis diffère significativement entre concentrations de nématodes, stades de développement des insectes et entre isolats de nématodes entomopathogènes. Tableau 2: Effet de différentes concentrations de nématodes entomopathogènes sur la mortalité des larves, des pupes et des adultes de Cylas puncticollis

16 Résultats et discussion 5/11 Stade Isolat Equation Probit CL 50 Valeurs avec intervalles de confiance Larve Ze4y= -0,258+1,466D1,500 (1,051-1,986)C Bemberekey= -0,692+1,530D2,834 (2,156-3,591)B Hessa2y= -0,527+1,13D2,928 (2,037-3,942)AB Dangboy= -1,311+2,235D3,859 (3,190-4,617)AB Korobororouy= -1,402+2,139D4,524 (3,739-5,416)A Pupe Ze4y= -0,197+1,589D1,331 (0,942-1,745)B Hessa2y= -0,291+1,419D1,604 (1,121-2,131)B Korobororouy= -0,401+1,509D1,847 (1,344-2,391)B Dangboy= -0,617+1,429D2,705 (0,652-5,834)B Bemberekey= -0,988+1,440D4,850 (3,768-6,101)A Adulte Ze4y= -0,627+1,321D2,981 (2,187-3,876)C Dangboy= -1,251+1,287D9,374 (7,308-12,026)B Hessa2y= -1,305+1,256D10,930 (8,503-14,176)B Bemberekey= -1,304+1,044D17,731 (13,136-25,385)AB Korobororouy= -1,609+1,186D22,764 (17,193-32,187)A  Un seul nématode est capable de provoquer la mort de l’insecte (36±4% en moyenne).  Mais la concentration 40 nématodes a engendré les plus grandes mortalités (90% en moyenne) Tableau 3: Nombre de larves infestantes de cinq isolats de nématodes entomopathogènes, capable de provoquer 50% de mortalité (CL 50 ) sur les larves, les pupes et les adultes de Cylas puncticollis, 48 heures après inoculation.

17 Résultats et discussion 6/11  Le seul isolat du genre Steinernema (Bembereke) a été en général moins efficace que tous les autres isolats (Ze4, Dangbo, Hessa2 et Korobororou) (F=33,35; Df=2; P<0,0001)  Conformité avec les travaux de Mannion et Jansson (1992); Nderitu et al. (2009); et Totin et al., 2014.  Ces résultats sont en lien avec ceux de Jansson et al. (1990) ; Ekanayake et al. (2001) El-Kholy et al., 2014).  Justification: Faible capacité du nématode à pénétrer la cuticule de l’adulte (P=1,2e-05); pas de différence entre larve et pupe pour la pénétration. Figure 3: Susceptibilité des larves, des pupes et des adultes de Cylas puncticollis aux nématodes entomopathogènes

18 Résultats et discussion 7/11 Isolat Stade BemberekeZe4Hessa2DangboKorobororouProbabilité Larves 9,27±1,315,67±1,656,57±0,814,50±1,106,58±1,25 <0,1362 Pupes 5,60±2,895,00±1,046,9±0,853,57±0,594,63±0,81 <0,1604 Adultes4,75±3,751,5±0,56±2,33,55±0,774±0,76<0,4956 Tableau 4: Nombre de nématodes ayant pénétré chaque stade de développement de Cylas puncticollis, exposé chacun à une dose de 20 nématodes, dans un tube Eppendorf, pendant 48 heures AA A A A A A A A A A A A A A AA A A A A A A AA A A AAA

19 Résultats et discussion 8/11 Isolat Stade BemberekeZe4Hessa2DangboKorobororouProbabilité Larve7,64±0,247,56±0,246,57±0,307,50±0,277,08±0,15<0,0235 Pupe7,8±0,207,4±0,247,30±0,47,71±0,196,82±0,33=0,1624 Adulte9,5±0,509±1,357,80±0,207,33±0,177,25±0,16<0,0066 Tableau 5: Emergence des nématodes, en nombre de jour après inoculation A B BA A A A A A A A A

20 Résultats et discussion 9/11 Tableau 5: Durée du cycle des nématodes entompathogènes, de l’infection par la larve infestante de NEPs à l’émergence de cette larve infestante, réalisé avec C. puncticollis Infection de C. puncticollis par la LI Emergence de la LI Ze4 (7 à 9 jrs) Infection de C. puncticollis par la LI Emergence de la LI Korobororou (7 jrs) Infection de C. puncticollis par la LI Emergence de la LI Dangbo (7 à 8 jrs) Infection de C. puncticollis par la LI Emergence de la LI Hessa 2 (7 à 9 jrs) Infection de C. puncticollis par la LI Emergence de la LI Bembereke (8à 10jrs)  Selon Nguyen et al. (1996) le cycle vital des NEPs varie selon le genre et l’espèce de nématode et varie de (7 jours en moyenne chez les Steinernematidae et 10 à 12 jours chez les Heterorhabditidae.  Mais ces études ont été réalisée avec les larves de G. melonnella

21 Résultats et discussion 10/11 Figure 3: Nombre de larves infestantes récolté, sept jours après la première émergence, exprimée par milligramme d’insecte. La barre au dessus d’une colonne représente l’erreur standard de la moyenne.  Tous les isolats testés se sont multipliés à l’intérieur de C. puncticollis

22 Résultats et discussion 11/11  Une de larve de C. puncticollis parasité par 5 LI de Dangbo, produit en moyenne 16 230 LI de NEPs à l’intérieur de la larve au bout de 15 jours après inoculation.  Ce nombre est nettement inférieur au nombre de LI produite par une larve de Galleria mellonella, soit 350 000 avec H. bacteriophora (Milstead et Poinar, 1978),  Ceci est dû au fait que la taille d’une larve de G. mellonella est supérieure à celle de d’une larve de C. puncticollis.

23 Résultats et discussion 11/11  Ce nombre de LI de NEPs produit par la larve de C. puncticollis est toute fois importante, car une fois dans le sol, ces nématodes parasiteront d’autres insectes de C. puncticollis et d’autres parasites également;  Ceci montre que la lutte par utilisation des NEPs est très avantageux;

24 Conclusion 1/1  Virulence Ze4  Forte aptitude à la pénétration Dangbo  Fort potentiel de reproduction Dangbo  Les Heterorhabditis sont en général plus efficaces que le seul Steinernema testé; les adultes sont moins susceptibles;

25 Conclusion 1/1  L'ensemble de ces résultats nous permet de mettre en œuvre à titre expérimentale un traitement in situ avec ces 5 isolats afin d’évaluer;  L'efficacité de la réduction des populations de C. puncticollis après traitements inondatifs ;  Le suivi des populations de NEPs pour mesurer leur persistance et éventuellement leur dissémination  Les effets de ces traitements sur la pédo-faune du la parcelle (le but étant de les minimiser).

26 Toutes nos remerciements sont adressés à la fondation Bill et Melinda GATES pour son appui technique et financier