S7 : Technologie et biotechnologie végétales Technologies et biotechnologies végétales Marie-Françoise Niogret Antoine Gravot UMR 6026 Interactions Cellulaires.

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1 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Technologies et biotechnologies végétales Marie-Françoise Niogret Antoine Gravot UMR 6026 Interactions Cellulaires et Moléculaires

2 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Transformation de matière première en biens ou services par le moyen d’organismes vivants » Fermenteurs Bioréacteurs

3 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés »

4 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale» Bretagne Biotechnologies Végétales Meristem Therapeutics

5 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales « Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale» Haplodiploïdisation Culture de méristèmes Micropropagation Sauvetage d’embryons Fusion de protoplastes Création de variabilité Banque de germoplasmes … www.srpv-bretagne.com

6 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Développement et application d’outils moléculaires dans différents domaines relatifs à l’agronomie et la médecine » Science Museum/Science & Society Picture Library

7 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Définitions Issues du génie des procédés (école allemande) – Définition historique (Karl Ereky), début XXème Production de biens à partir de matière première en utilisant des organismes vivants Utilisation des techniques de fermentation et dérivées – Mots clés : génie des procédés, production industrielle Issues du génie génétique (école américaine) – Depuis les années 70 « Utilisation des techniques de l’ADN recombinant » – Mots clés : ADN recombinant, protéines hétérologues, organismes génétiquement modifiés Gerard Siclet : Technologies de pointe mettant en œuvre des processus cellulaires ou moléculaires, grâce au génie génétique Plaçant au premier plan les applications industrielles et commerciales – Définition OCDE 1980 : Mise en œuvre de matériel biologique pour la production de biens et de services En Europe : définitions concernant spécifiquement le végétal et insistant soigneusement sur les technologies ne faisant pas appel à la transgenèse Plus récemment : définitions incluant les approches de génomique

8 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales : Domaines abordés dans ce cours : Ensemble de pratiques faisant appel aux cultures in vitro de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale Cultures in vitro Biologie moléculaire Agronomie : Création variétale, Multiplication conforme, Identification variétale… Recherche fondamentale Industrie Production de composés ou de protéines d’intérêt alimentaire et non-alimentaire

9 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Au programme… Les cultures in vitro – Totipotence de la cellule végétale – Techniques de base de culture in vitro – Applications technologiques: micropropagation, sauvetage d’embryon, haplo/diploïdisation, fusion de protoplastes… – Applications en recherche : signalisation, adressage de protéines, échanges d’ions et de métabolites Biotechnologie moléculaire – Bases de la transgenèse des végétaux – Applications en agriculture conventionnelle – Applications dans la valorisation non alimentaire des productions végétales Production de protéines recombinantes Production de métabolites secondaires Phytoremédiation MF Niogret

10 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux pratiques Rôle des substances de croissance dans l’organogenèse et composition des milieux de culture Préparation et fusion de protoplastes Caractérisation et phénotypage de mutants d’Arabidopsis

11 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux dirigés Préparation d’un exposé concernant un domaine de la biotechnologie végétale Réalisation d’un dossier concernant un gène chez Arabidopsis thaliana – Expression tissulaire, régulation, fonctions connues – Brevets – Démarche concrète d’obtention de mutants

12 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Totipotence chez le végétal Signification et limites

13 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Plan Quelques définitions Naissance et développement des cultures in vitro Applications et limites de la totipotence Mécanismes sous-jacents à la totipotence Signification biologique de la totipotence des cellules végétales

14 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Quelques définitions Cellules totipotentes: cellules issues des premières division de l'oeuf fécondé capables de donner naissance à tous les types de cellules de l'organisme et les seules à permettre le développement complet d'un individu. Cellules pluripotentes : Capacité que possède une cellule de se différencier en environ 200 types cellulaires représentatifs de l’ensemble des tissus (cellules souches embryonnaires issues d’embryons de 5 à 7 jours) Cellules multipotentes : capables de donner naissance à plusieurs types cellulaires (les cellules souches myéloïdes de la moelle osseuse sont à l’origine des cellules sanguine) Chez les animaux Spécificité du végétal Chez les plantes, la totipotence peut se définir comme la propriété qu’ont certaines cellules de pouvoir régénérer un individu lorsqu’elles sont placées dans des conditions appropriées, en passant éventuellement par une étape de dédifférenciation

15 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Exemple : microbouturage du Saint Paulia 2 mois plus tard Source : http://www.didier-pol.net/1CLONES.html

16 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Historique La totipotence comme fil conducteur de la naissance des biotechnologies végétales

17 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes Contexte théorique au début du XX ème siècle: – Théorie cellulaire (Schleiden et Schwann) – Microbiologie et biochimie Comment étudier le comportement de cellules isolées ? Cultures en conditions stériles Caractérisation de substances de croissance

18 S7 : Technologie et biotechnologie végétales G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale Aspects historiques Deux idées importantes : la culture de cellules isolées constituerait potentiellement un modèle de recherche maintient en vie de cellules isolées Pas de multiplication cellulaire on peut potentiellement régénérer une plante entière à partir d’une cellule isolée  totipotence Échec (mauvais choix d’explants, méconnaissance des substances de croissance) http://users.ugent.be/~pdeberg h/his/his2az1.htm

19 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Émergence des techniques de culture – Haberlandt (1902) : concept de totipotence – White (1934) : culture in vitro de racines de tomates – Gautheret (1935) : utilisation d’auxine pour cultiver du cambium de saule – 1939 : 1ère culture indéfinie de cals de carotte Aspects historiques La culture de tissus est possible en utilisant des substances de croissance et/ou des tissus méristématiques https://www2.carolina.com

20 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Émergence des techniques de culture – Braun (1941) : travaux sur le crown gall – Miller (1955) : cytokinines – Murashige et Skoog : mise au point de milieux de culture efficaces contenant des cytokinines et des auxines Aspects historiques Croissance in vitro des tumeurs sans ajout d’hormones

21 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Confirmation des hypothèses d’Haberlandt 1956 (Muir) suspensions cellulaires 1958 (Reinart et Stewart) Embryogenèse somatique chez la carotte Aspects historiques

22 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Confirmation des hypothèses de Haberlandt 1965 (Vasil et Hilderbrandt) Régénération d’un plant de tabac à partir d’une cellule unique 1971 (Nagata et Takabe) Régénération d’un plant entier à partir d’un protoplaste Aspects historiques

23 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Développements : des outils agronomiques 1965 (Morel) multiplication in vitro des orchidées 1972 (Sharp) : tomates haploïdes à partir de pollen 1973 : hybride issu d’une fusion de protoplastes Aspects historiques

24 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Développements : production de métabolites secondaires 1977 : culture de cellules de tabac dans un réacteur de 20 000 litres 1983 (Mitsui Petrochemical) : production industrielle de métabolites secondaires Aspects historiques

25 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Développements : la transgenèse Van Montaigu (1983) : tabac résistant à la kanamycine 1994 : Flavr Savr (Calgene, antisensage d’une polygalacturonase) 1996 : maïs transgénique commercialisé aux USA Aspects historiques

26 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Conclusions Problématique initiale : – recherche d’un modèle de cellules isolées – démonstration de la totipotence des cellules végétales Aspects historiques Identification du rôle des substances de croissance Mise au point de nombreuses techniques Transgénèse

27 S7 : Technologie et biotechnologie végétales La totipotence : applications et limites

28 Meristème Apex caulinaire Nœud Culture de méristème Enracinement Plantules Tige feuillée Morphogenèse indirecte Callogenèse cal Suspensions cellulaires Caulogenèse indirecte Embryogenèse somatique indirecte Morphogenèse directe Caulogenèse directe Embryogenèse somatique directe Semences artificielles Principales méthodes de micropropagation D’après Lindsey et Jones 1989 Explants divers (racines, tige, feuilles…)

29 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Des cellules plus ou moins totipotentes Les méristèmes : un réservoir de cellules totipotentes Les autres types cellulaires : une totipotence plus ou moins facile à exprimer Utilisation de substances de croissance exogènes Régénération directe Régénération en passant par un stade de cal Variabilité interspécifique

30 S7 : Technologie et biotechnologie végétales

31 Limites de la totipotence : impossibilité technique Différentiation irréversible : xylème (!) En fonction de la méthode de préparation des protoplastes, récalcitrance à la régénération Pour beaucoup d’espèces d’intérêt agronomique, les protoplastes ne sont pas totipotents (récalcitrants) ex : Vitis vinifera

32 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Limites de la totipotence : Variation somaclonale Les plantes régénérées présentent souvent des problèmes – Perte de caractères chimériques – Aneuploïdies, délétions chromosomiques Modification du caractère juvénile – Impact sur la fertilité

33 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Mécanismes sous-jacents à la totipotence Chez les cellules végétales

34 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Pourquoi les cellules végétales sont totipotentes : Arguments classiques Petit nombre de types cellulaires Seulement 3 ou 4 types d’organes fondamentaux (racine, tige, feuilles) dont les fleurs, vrilles, épines, fruits et tubercules sont des dérivés Grande plasticité génomique – la croissance peut rester presque normale malgré de profonds remaniements chromosomiques

35 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Etapes liées à la totipotence Etape 1 : – Cellules différentiées : dédifférenciation nécessaire – Cellules souches méristématiques Etape 2 : mise en route de l’activité mitotique  utilisation de substances de croissance Etape 3 : autonomie de la croissance tissulaire vis-à- vis des substances de croissance exogènes Enjeux scientifiques actuels: Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Comprendre la nature des cellules souches

36 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Modulation de l’expression génétique via des mécanismes épigénétiques – Reconformation de la chromatine Modification des histones Méthylation de l’ADN

37 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre la nature des cellules souches Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

38 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Signification de la totipotence Pourquoi les cellules de plantes sont-elles totipotentes ?

39 S7 : Technologie et biotechnologie végétales F. Hallé : la totipotence est une spécificité des organismes autotrophes fixés On retrouve la totipotence des cellules chez les coraux quels sont les autres points communs coraux / plantes ? Signification de la totipotence

40 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Points communs coraux/plantes Croissance indéfinie Zones méristématiques Morphologie type « fractales » Autotrophie, faible flux énergétique Vie fixée Durée de vie potentiellement illimitée Squelette de nature excrémentielle Signification de la totipotence

41 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Autotrophie : Faible flux énergétique Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Lutte contre la croissance homothétique Développement en axes ramifiés Signification de la totipotence

42 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Autotrophie : Faible flux énergétique Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Lutte contre la croissance homothétique Développement en axes ramifiés Signification de la totipotence

43 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Autotrophie : Faible flux énergétique Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Lutte contre la croissance homothétique Développement indéfini à partir des méristèmes Totipotence des cellules méristématiques Développement en axes ramifiés Signification de la totipotence

44 S7 : Technologie et biotechnologie végétales Architecture adaptée à l’autotrophie Réactivité du développement dans un contexte de vie fixée Multiplication végétative Fonctions biologiques de la totipotence