Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs

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1 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs
TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques. titre

2 2 Situation des prélèvements.
L’échantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques d’impacts de météorites. 2 L’échantillon B a été recueilli sur les pentes d’un « pic » qui résulte sans doute de l’impact d’un astéroïde de grande taille au pôle sud. L’échantillon A provient de la cheminée d’un ancien volcan.

3 2 Situation des prélèvements.
Ils ont été passés au spectromètre de masse. Cela a permis de mettre en évidence des traces de huit acides aminés. Ce n’est pas surprenant en soi, mais comparez les trois profils et dites ce que l’on peut en déduire. L’échantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques d’impacts de météorites. 2 L’échantillon B a été recueilli sur les pentes d’un « pic » qui résulte sans doute de l’impact d’un astéroïde de grande taille au pôle sud. L’échantillon A provient de la cheminée d’un ancien volcan.

4 3 Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
-- La Tyrosinase est une enzyme qui catalyse la formation des pigments dans les mélanocytes de la peau et les follicules pileux. On l’appelle tyrosinase car la première étape consiste en la transformation de la tyrosine. Elle est aussi présente chez les végétaux, mais on ne sait pas trop à quoi elle sert. Elle provoque le brunissement des fruits et des légumes en présence de dioxygène. 3 -- Si nous mettons en évidence une activité tyrosinase, nous aurons démontré qu’il existe un métabolisme complexe sur cette planète naine. -- Et la présence de vie ? -- Métabolisme ne veut pas dire nécessairement vie. Mais c’est une première étape.

5 3.1 4 MC Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- La méthode la plus simple est celle qui utilise le 4MC. Elle se base sur le principe que la tyrosinase est une enzyme relativement peu spécifique. Elle reconnaît plusieurs substrats différents qui possèdent une analogie de structure avec les 2-diphénol. Elle catalyse la réaction ci-contre: 3.1 4 MC -- Le 4 Méthyl catéchol (4 MC) correspond à cette catégorie. Lorsqu’il subit la réaction, il donne un produit coloré, la quinone:

6 3.1.1 cin prélim Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). 1.1. Cinétique préliminaire. -- On commence par une cinétique pour tester la valeur de dilution de l’extrait. On prépare le mélange réactionnel : - 1,5 mL de tampon acétate - 1 mL de 4 MC à 5 mmol.L-1 - 2,8 mL d'eau On ajoute 0,2 mL d'extrait à t = 0 s et on note l'absorbance à 400 nm à t = 15 s et t = 135 s. Si cette dernière est comprise entre 0,8 et 1,2 c’est bon. On peut l’utiliser. Si elle est supérieure, On le dilueras et on recommence le test. On ne teste qu’un seuk échantillon, celui qui est le plus pertinent. 3.1.1 cin prélim Déterminer l’échantillon à tester ! -- Ensuite, on laisse la réaction aller à son terme. Lorsque l'absorbance ne varie plus, on note l’absorbance et on évalue la valeur de e.quinone. Déterminer et justifier la méthode de calcul !

7 3.1.2 param enz Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). 1.2. Détermination des paramètres enzymatiques. -- Pour la détermination des paramètres, on suit les instructions du tableau. On utilise les données de la cinétique pour choisir une dilution adéquate de l’extrait. Vérifier que la cinétique est linéaire entre 15 et 135 s. I II III IV Tampon acétate (µL) 550 4MC (à 5 mmol.L-1) (µL) 500 350 250 125 pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2O qsp 2 mL (après addition de l’extrait) Extrait A, B, et C (µL) 100 Tampon d'arrêt 2 mL 3.1.2 param enz Comparer les échantillons et conclure. - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 390 nm pendant 5 mn

8 3.2 catéchol 265 Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
2. Méthode « catéchol 265 » (pour information). Il faut faire un essai préliminaire (avec quel tube ?) pour vérifier que le volume de la prise d’extrait est bien adapté et déterminer si une dilution est nécessaire. -- Il serait intéressant de comparer ces résultats avec ceux d’une méthode voisine. Nous nous contenterons de l’extrait E-A. Nous allons utiliser le catéchol comme substrat. Contrairement à son dérivé, le 4-MC, il possède un pic d’absorbance à 265 nm. - On définit une unité de tyrosinase comme la quantité qui provoque une diminution d’absorbance de 0,001 uA par minute dans ces conditions opératoires. -- Il ne suffit plus que d’appliquer le protocole décrit par le tableau. 3.2 catéchol 265 I II III IV ac ascorbique (5 mmol.L-1) 50 EDTA (0,065 mmol.L-1) Catéchol (5 mmol.L-1) 100 150 200 Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de l’extrait) Solution de conversion UV pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL) La solution de conversion permet de modifier l’absorbance de la solution. Des UV elle passe dans le visible. Ne pas faire le zéro - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 430 nm pendant 5 mn

9 3.3 DL DOPA 475 Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.
3. Méthode « DL DOPA 475  » (pour information). -- La méthode à la DOPA utilise le substrat naturel de la tyrosinase. L’avantage est que l’on connaît de e du dopachrome (e = 3 600 mol-1.L.cm-1)  -- Le protocole est particulièrement simple à suivre. 3.3 DL DOPA 475 La encore il faut faire un essai préliminaire pour déterminer le volume de prise d’essai et la dilution éventuelle. I II III IV DL DOPA (20 mmol.L-1) 500 750 1000 1 200 Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de l’extrait) pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL) ? La variation d’absorbance doit être comprise entre 0,03 et 0,3 uA.mn-1. La période de linéarité est alors inférieure ou égale à 3 mn. Au-delà, un brunissement du milieu réactionnel est normal. - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 405 nm pendant 3 mn

10 5.1 bisulf Influences environnementales. 1. Effet du méta-bisulfite.
Quand on analyse globalement la manip, on se rend compte qu’il n’est pas obligé de préparer tous les tubes décrits dans le tableau. Influences environnementales. 1. Effet du méta-bisulfite. C’est un agent réducteur puissant capable d’inhiber un certain nombre d’enzyme. En quoi un réducteur peut-il interférer sur le pouvoir catalytique de la tyrosinase. Vol en mL I II III IV Tampon acétate (µL) 550 4MC (à 5 mmol.L-1) (µL) 500 350 250 125 Méta-bisulfite de Na : (0,25 mmol.L-1) (en µL) 50 100 pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2O qsp 2 mL (après addition de l’extrait) Extrait E-A (µL) tampon d'arrêt 2 mL noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s) 5.1 bisulf

11 Développer cette argumentation.
Influences environnementales. -- Le principe de la manipulation est le même que pour le prélèvement B. On garde le bocal et on change les cornichons ! 2. Effet du cinaminate. -- Nous devons tester le prélèvement C qui contient de l’acide cinaminique. Quand on voit la molécule, on devine par quel mécanisme il peut bloquer le fonctionnement de l’activité tyrosinase. Développer cette argumentation. 5.2 cinam Vol en mL I II III IV Tampon acétate (µL) 550 4MC (à 5 mmol.L-1) (µL) 500 350 250 125 ac cinaminique (3 mmol.L-1) (en µL) 20 50 80 100 H2O qsp 2 mL (après addition de l’extrait) Extrait E-A (µL) Tampon d'arrêt 2 mL noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s)

12 conclusion -- Il ne me reste plus qu’à taper le rapport.
-- Qu’est-ce qu’on y attend exactement ? -- Tous les calculs de vitesses justifiés par les choix de manip. L’analyse comparée de ces résultats et les conclusions. La routine, quoi. conclusion