TRAHISON titre TD 5 / 6 épisode 5.

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1 TRAHISON titre TD 5 / 6 épisode 5

2 Présence de structures d’origine bactérienne:
1 Serre. 1.1. Cueillette. Identifier les structures visibles à la surface des racines sur la photo A. Quelles sont les particularités des cellules végétales (photo C)? Quel est le nom de la zone X? Commenter l'aspect du cytoplasme de la zone X. 1.1.1 Paroi cellulosique Nodule caulinaire vacuole Chloroplastes Présence de structures d’origine bactérienne: les bactéroïdes Bactéries

3 La distinction n’est pas toujours évidente!
1 Serre. Indiquer la réaction catalysée par la nitrogénase. 1.2. Métabolisme. 1.1. Cueillette. 6.e- N2 + 6.H+ 2.NH3 1.2.1 12.ATP + 12 H2O 12.ADP + 12 Pi Nommer la relation entre la plante et le rhizobium. Symbiose: association obligatoire entre deux organismes où chacun d’eux en tire un bénéfice. La distinction n’est pas toujours évidente! Mutualisme: association non obligatoire entre deux organismes où au moins l’un d’entre eux en tire un bénéfice.

4 1 Serre. Calculer les paramètres enzymatiques des quatre systèmes (utiliser la méthode d'Eadie – Hofsize). 1.2. Métabolisme. V = f ( S / V ) Vm Km R Bengali 15 650 R Cachemire 5 630 R Pondichéry 25 340 R Bhrama 12 123 mmol.h-1 mbarr 1.2.3

5 1 Serre. Qui sont Sîta et Râma? Quel texte raconte leur aventure? 1.3. Mise au point. La princesse Sîta a été enlevée par Râvana, le roi des démons. Le prince Râma est parti à sa recherche, aidé par Hanuman, le roi des singes. Ses aventures sont racontées dans le Ramayana. 1.3.1

6 2.1.1 1 Serre. 2. Clones. 1.3. Mise au point. 2.1. Isolement.
Commenter les propos de Rachel: " La liberté est le filet avec lequel pêchent les démons." Partagez-vous ce point de vue? 2.1.1 Vaste sujet...

7 fraction cytoplasmique
2. Clones. 2.1. Isolement. Résumer la manipulation par un organigramme. broyage + cellulosidase + RIPA 2.1.2 surnageant filtration fraction cytoplasmique

8 fraction cytoplasmique
2. Clones. 2.1. Isolement. Résumer la manipulation par un organigramme. + lysozyme + chloroforme / phénol 2.1.2 suite protéine + éthanol fraction cytoplasmique ADN mise en suspension électrophorèse

9 Dégrade la paroi bactérienne Dégrade la paroi végétale
2. Clones. 2.1. Isolement. Donner le rôle de chacun des réactifs ajoutés. Résumer la manipulation par un organigramme. Dégrade la paroi bactérienne Dégrade la paroi végétale fraction cytoplasmique + lysozyme + chloroforme / phénol protéine + éthanol ADN électrophorèse mise en suspension + cellulosidase + RIPA surnageant filtration fraction cytoplasmique 2.1.3 Précipite les protéines Détergent: dégrade la membrane Précipite l'ADN

10 Permet de bloquer les nucléases.
2. Clones. Quel est l'intérêt d'une filtration après la centrifugation à 1 000g? 2.1. Isolement. Pourquoi travailler dans la glace? Donner le rôle de chacun des réactifs ajoutés. Résumer la manipulation par un organigramme. Permet de bloquer les nucléases. fraction cytoplasmique + lysozyme + chloroforme / phénol protéine + éthanol ADN électrophorèse mise en suspension + cellulosidase + RIPA surnageant filtration fraction cytoplasmique 2.1.4 Séparer le culot (débris cellulaires) du surnageant. Eliminer du surnageant les débris cellulaires de taille "moyenne".

11 Seule référence disponible
2. Clones. Calculer le rendement de purification des étapes 3, 5, 6. 2.1. Isolement. Etapes masse (g) masse ADN (µg) broyat 850 + cellulosidase+ RIPA filtration filtrat 678 centrifugation culot 123 120 + lysozyme + phénol/chloroforme Surnageant + éthanol 0,55 75 mise en suspension électrophorèse bandes 0,00008 0,15 purification rendement rendement mADN mtotale % ADN % ADN réf 2.1.6 1 3 123 Seule référence disponible = 9, 1 75 / 120 = 0,61 0,00136 / 9, 5 = 0,00136 = 139,8 6 = 0,1875 = 1 921,9 0,15 / 120 = 0,0012

12 2.1.7 2. Clones. 2.1. Isolement. 2.1.7. Que signifie l'unité kb?
ADN lourd et abondant: kilobase = paires de base Chromosome 2.1.7 Identifier les deux bandes présentes sur le gel. ADN léger et peu abondant: Plasmide

13 2.2.1 2. Clones. 2.2. Séquençage. 2.1. Isolement.
Possibilité d’hybridation intra-chaîne Que peut-on déduire de l'analogie de séquence constatée? Une analogie de séquence laisse supposer une analogie de protéine. Axe de symétrie Origine de réplication. Qu'est-ce qu'un site ori? 2.2.1 La réplication du plasmide est coordonnée avec la réplication du chromosome. Qu'appelle-t-on contrôle strict de réplication? Quel intérêt présente l'existence des sites BamH1 et Xba1? Est-ce une bonne chose qu'il existe deux sites de restriction différents sur le plasmide? Les sites de restriction permettent de séparer l’insert du plasmide. Deux sites différents permettent de contrôler le sens d'insertion dans le vecteur. Site de restriction Structure tridimensionnelle. Reconnaissance spécifique par une endonucléase. Quel est le mécanisme moléculaire de reconnaissance des enzymes de restriction?

14 Ligation par extrémités cohésives (sticky)
2. Clones. 2.3. Préparation du plasmide. 2.2. Séquençage. Expliquer la technique de ligation du fragment au vecteur. Ligation par extrémités cohésives (sticky) plasmide d’origine 2.3.1 ligation plasmide vecteur endonucléase de restriction BamH1 coupure endonucléase de restriction BamH1 ligase

15 2.3.2 2. Clones. 2.3. Préparation du plasmide. pUC
Qu'est-ce qu'une protéine de fusion? Quelle est sa composition dans le cas de pUC? Protéine résultant de la traduction de deux gènes (ou fragments de gènes) consécutifs. 2.3.2 pUC b-gal coupure insertion fragment de b-gal transcription traduction protéine insérée

16 2.3.3 2. Clones. 2.3. Préparation du plasmide.
Criblage immunochimique. Expliquer la technique de criblage utilisée. Quel est son nom? On utilise des anticorps spécifiques marqués (fluorochrome ou radioactifs) AC anti b-gal AC anti prot insérée 2.3.3 Attention: La protéine insérée ne possède pas forcément la même conformation quand elle est fusionnée. fragment de b-gal Attention: Le fragment de b-gal est peut-être masquée par la protéine insérée. protéine insérée

17 Des plasmides recombinants
2. Clones. 2.4. Recombinant. 2.3. Préparation du plasmide. C’est un bon compromis entre la température optimale de la ligase (37°C) et la stabilité des liaisons hydrogènes maintenant les deux extrémités cohésives ensemble. Pourquoi Angie choisit-elle le préparer le plasmide à 15°C? 2.4.1 Quels types de plasmide Angie obtient-elle? Des plasmides recombinants et non recombinants. Plus la quantité d’insert est importante plus la probabilité d’insertion est grande. Quelle est l'importance de la proportion insert/vecteur? Il va déphosphoryler les extrémités 5'-phosphate du plasmide, ce qui interdit la ligature Quel est le rôle du traitement à la phosphatase alcaline? Avec quel type d'enzyme de restriction le vecteur est-il linéarisé? BamH1 et Xba1

18 3.1.1 3. Protéine recombinante. 2. Clones. 2.4. Recombinant.
3.1. Transformation. Electroporation. Comment se nomme cette technique de transformation? En expliquer le mécanisme d’action. Le courant électrique perturbe l’arrangement des phospholipides eux-mêmes chargés. C’est un inducteur de la synthèse de la b-gal (et donc de la protéine fusion). 3.1.1 Qu'est-ce que l'IPTG? Quel est son action? Quel est le rôle du ...galactopyranosyl? Donner sa formule. Appelé aussi X-gal, c’est un substitut du lactose. Il est transformé par la b-gal en une molécule bleue. Isopropylthiogalactosyl

19 3.1.4 3. Protéine recombinante. 3.1. Transformation.
Pour sélectionner les bactéries transformées (qui ont acquis la résistance à l’antibiotique grâce au plasmide vecteur). Pourquoi ajouter de l'ampicilline? Quel type de protéine est-il produit par la bactérie? La protéine fusion.

20 3.2.1 3. Protéine recombinante. 3.1. Transformation.
Quel est la couleur des colonies positives? 3.1. Transformation. 3.2. Criblage blanc/bleu. Les bactéries possèdent une b-gal fonctionnelle capable de métaboliser le X-gal. Colonies bleues: Le vecteur n’a pas intégré l’insert. 3.2.1 Les bactéries ne possèdent pas de b-gal fonctionnelle. Elles ne métabolisent pas le X-gal. Colonies blanches: Colonie positive. Quel est le rôle du lait dans la manipulation? Le vecteur a intégré l’insert. Saturer les sites non spécifiques. Lorsque la traduction du gène donne une protéine incorrecte. Dans quel(s) cas une colonie positive ne serait-elle pas reconnue par l'anticorps? Si l’insertion provoque un décalage de lecture (2 cas sur 3). Lorsque la présence de la partie b-gal modifie la conformation le la partie insérée. NB: le sens de lecture est correcte car le clonage est directionnel !

21 3.3.1 3. Protéine recombinante. 3.3. PCR.
Cette manipulation est-elle vraiment utile? NON: le criblage immunochimique a déjà permis d’identifier les clones positifs. 3.3.1 Quel est le rôle des changements de température? 94°C 55°C 74°C dénaturation des matrices. hybridation des deux brins. élongation des brins néoformés. Quelle amorce doit-elle utiliser? 2 amorces complémentaires de séquences localisées avant et après l’insert.

22 3.4.1 3. Protéine recombinante. 3.3. PCR. 3.4. Séquençage.
Donner le principe de cette méthode de séquençage. Quel est la particularité chimique des didésoxynucléosides? 3.4.1 Didésoxyadénine (didésoxynucléotide) Adénine (nucléotide) Désoxyadénine (désoxynucléotide) La présence de didésoxynucléotide bloque l’élongation de l’ADN. La longueur d’un fragment indique la position du nucléotide.

23 Electrophorèse sur capillaire
3. Protéine recombinante. Par quelle méthode les brins d'ADN formés sont-ils séparés pour identification? 3.4. Séquençage. matrice C C G T A A T C G G A T C G T T A G C G G G T G C C C A A G C T G A G G C A T T A G C C T A G C A A ddT Electrophorèse sur capillaire G G C A T T A G C ddC Electrophorèse dA 3.4.2 suite dG G ddG G G C A T ddT ddG Réplication G G C A ddT ddT dC G G C A T T A G C C T A G C A A T C C G C Cdd A ddA G G C A T T A G C C T A G C A A T C ddC dT G G C A T T A ddG ddC G G C A T T A G C C T ddA G G C A T T A G C C T A G C A A T C C G C ddC La réplication s’interrompt lorsque le brin d’ADN a intégré un didésoxynucléotide. Désoxynucléotides (normaux) G G C A T T A G C C T A G C ddA G G C A T T A G C C ddT Didésoxynucléotides (fluorescents)

24 3.5.1 3. Protéine recombinante. 3.4. Séquençage.
Comment, par cette technique, peut-on mesurer la concentration d'un plasmide? Tracer Ln(Ifluo) = f(cycle). Tracer le graphe Ifluo = f (cycle). Que peut-on en tirer? 3.4. Séquençage. 3.5. PCR quantitative. Dans ce type de représentation, une droite représente une fonction exponentielle. La synthèse est régulière et continue. La Ct (threshold cycle = cycle seuil) est le cycle pour lequel la fluorescence des échantillons dépasse la ligne de base et devient identifiable. Longueur de l’insert. NON: même insert ! 3.5.1 Concentration initiale OUI: dépend de la bactérie Angie choisit la colonie 1 Elle produit presque deux fois plus de plasmide que la 2 ! Quelle souche Angie va-t-elle choisir? Justifier en calculant la valeur du rapport des concentrations des deux inserts au départ. Expliquer la présence de parties linéaires. Ifluo1 / Ifluo2 = 2,92 Pas grand chose. Qu'appelle-t-on Ct? Mesurer sa valeur dans les deux cas. Qu'appelle-t-on Ct? Mesurer sa valeur dans les deux cas. Comparer les deux valeurs. Qu'est-ce qui peut expliquer la différence constatée? Colonie 1 20 Colonie 2 21 Colonie 1 20 Colonie 2 21

25 3.5.7 3. Protéine recombinante. 3.5. PCR quantitative.
Comment, par cette technique, peut-on mesurer la concentration d'un plasmide? 3.5. PCR quantitative. 3.5.7 Ifluo / Ifluoét = Ci / Ciét On compare avec un étalon de concentration connue.

26 ? 3.5.8 3. Protéine recombinante. 3.5. PCR quantitative.
Comment calculer la Tm des deux échantillons. 3.5. PCR quantitative. De quels paramètres la valeur de Tm dépend-elle? 3.5.8 ? Les deux inserts sont identiques. Des proportions G-C et A-T Que peut-on déduire de ces valeurs dans ce cas précis? On cherche le point d’inflexion des courbes.

27 3.5.11 3. Protéine recombinante. 3.5. PCR quantitative.
Que représente la dérivée d'une fonction? Expliquer l'intérêt de ce graphe par rapport au précédent. Que représente la dérivée d'une fonction? Expliquer l'intérêt de ce graphe par rapport au précédent. 3.5. PCR quantitative. L’axe des ordonnés indique la pente de chacun des points. 3.5.11 Les points d’inflexion deviennent des pics (plus lisible).

28 La colonie 2 a amplifié deux séquences:
3. Protéine recombinante. Calculer à nouveau les Tm. 3.5. PCR quantitative. Que peut-on en déduire? Quelle bactérie Angie va-t-elle choisir? 3.5.12 La colonie 2 a amplifié deux séquences: Produit non pur. La colonie 1 77°C 85°C