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2 1. Attirance. 1.1. Séparation ? Quel type de chromatographie Mitra a-t-elle utilisé? Chromatographie d'échange d'ions. Phase stationnaire 1.1.1 Expliquer le principe de l'élution au cours de ce type de chromatographie. Donner son nom. Parle-t-on d'élution par le solvant ou le soluté? Le soluté de l'éluant entre en compétition avec les molécules fixées sur la phase fixe et les remplace.

3 1. Attirance. 1.1. Séparation ? Expliquer la variation de concentration de l'éluant au cours de la manipulation. 1.1.3 0-40: Variation rapide car pas d'élution 40-160: Variation lente pour gagner en précision. 160-fin: Variation rapide car plus d'élution

4 1. Attirance. Que dire de la fraction GH? Quel paramètre de la colonne doit-elle améliorer? 1.1. Séparation ? Elution avec gradient Donner un nom à ce type d'élution. L’affinité d’une molécule apolaire pour une phase fixe apolaire Quel paramètre biologique est utilisé pour séparer les protéines dans une chromatographie de ce type? Citer une autre méthode d'élution. Que se passerait-il si la pente était plus faible et pourquoi a-t-elle choisi celle-ci? 1.1.4 Ces paramètres constituent un bon compromis. D pH Que signifie C16? La phase fixe est composée de chaînes à 16 carbones. Les deux pics sont mélangés. Il faut améliorer la résolution. La précision serait meilleure La durée serait plus importante Quel type d'interaction intervient entre la phase fixe et les protéines à séparer? Interactions hydrophobes. Solubiliser les molécules fixées Quel est le rôle de l'éluant?

5 1.2.1 1. Attirance. 1.1. Séparation ? 1.2. Replis.
Quel est le principe d'une séparation sur gel de Séphadex? 1.1. Séparation ? 1.2. Replis. Les billes réticulées retiennent les petites molécules. Comment appelle-t-on ce type de chromatographie? Chromatographie d’exclusion. 1.2.1 Quelle est la fraction la plus lourde? Fraction A A B C D E F

6 1. Attirance. Sur quel support a lieu la révélation par les anticorps? 1.2. Replis. Une membrane de nitrocellulose. Quel est le rôle du lait? A quel moment Mitra l'utilise-t-elle? 1.2.4 Masquer les sites non spécifiques. Elle l’utilise avant l’addition des AC. Analyser le protéinogramme. Que peut-on en conclure? Absence de toxine. Pas d'épidémie de Faucheur

7 S’il avait été du groupe AB Les AC ne reconnaissent pas
2. Le petit peuple. 1. Attirance. 2.1. Antigènes isotypiques. 1.2. Replis. Quel est le rôle du 4ème test? Quel résultat Mitra attend-elle? Interpréter les résultats des trois premiers tests. Quel est le groupe sanguin du kinnara? S’il avait été du groupe AB (pas d'AC) Vérifier auto-agglutination Dans quel cas (non pathologique) le test aurait-il été faussé? 2.1.1 Groupe O négatif Présence d’AC anti-A Présence d’AC anti-B Les AC ne reconnaissent pas les Ag de souris. Présence d’AC anti-A anti-B

8 2.1.5 2. Le petit peuple. 2.1. Antigènes isotypiques.
Quel est le rôle du SAB? 2.1. Antigènes isotypiques. Témoin négatif. Ag communs (isotypique/allotypique) Que peut-on dire des réactions du cobaye et de la souris? Ag communs avec Xena 2.1.5 Pas de réaction: Les Ag ne sont pas reconnus. Interpréter les arcs de Mitra et Xena. Ag différents (idiotypique) Interpréter la formation des arcs chez le kinnara. Les kinnaras possèdent des caractères communs avec les humains. Que peut-on conclure? Proposer une hypothèse sur la filiation des kinnaras et sur le processus qui a conduit à leur apparition. Que peut-on conclure? Proposer une hypothèse sur la filiation des kinnara et sur le processus qui a conduit à leur apparition. Ce sont sans doute des humains qui ont subit des mutations dues à la radioactivité.

9 2.2.1 2. Le petit peuple. 2.1. Antigènes isotypiques.
Pourquoi Mitra fait-elle varier le pH de l'éluant? 2.1. Antigènes isotypiques. 2.2. Hormone de croissance. De quelle protéine est constitué le pic à 40 mn? Justifier! Elle dénature la GH pour permettre son élution. (la méthode n’est pas préparative) Il s’agit de la GH Les autres protéines ne sont pas retenues pas la colonne. Comparer les deux profils chromatographiques. 2.2.1 Les deux profils sont très proches. Les GH de Mitra et du kinnara sont identiques.

10 2.2.4 2. Le petit peuple. 2.2. Hormone de croissance.
Pourquoi ne pas effectuer une électrophorèse en présence de SDS? Le récepteur dénaturé ne reconnaitrait pas la GH. 2.2.4 A quoi correspondent les deux bandes? Aux récepteurs de la GH. Conclure. Les kinnaras possèdent des récepteurs différents de ceux des humains normaux.

11 Quantité d’enzyme transformant 1 µmol.mn-1 de S
2. Le petit peuple. Indiquer les équations des courbes dans le cas des représentations de: 2.2. Hormone de croissance. 2.3. Iso-enzymes. Lineweaver et Burk 2.3.1 1/V = f ( 1/S ) Quelle est la définition d'une unité enzymatique? Tracer ces trois représentations. Quantité d’enzyme transformant 1 µmol.mn-1 de S Hanes - Woolf S/V = f ( S ) Eadie - Hofsize V = f ( V/S )

12 2.3.3 2. Le petit peuple. 2.3. Iso-enzymes. 2.3.4. Calculer Vm et Km.
Déterminer l'activité des deux fractions en UE puis en UE.mL-1. Lineweaver et Burk 1/V = f ( 1/S ) kinnara 100 µL Mitra 10 µL Vm 27,8 18,5 nmol.mn Km 14 8,4 µmol.L-1 kinnara 100 µL Mitra 10 µL Vm 83,4 55,5 nmol.3mn Km 14 8,4 µmol.L-1 pour 3 mn 2.3.3 Tracer ces trois représentations. Hanes - Woolf S/V = f ( S ) Eadie - Hofsize V = f ( V/S )

13 2.3.5 2. Le petit peuple. 2.3. Iso-enzymes.
Etant données les circonstances, laquelle est la plus probable? 2.3. Iso-enzymes. Déterminer l'activité des deux fractions en UE puis en UE.mL-1. Mitra a constaté la présence d’iso-enzymes. Il s’agit sans doute de la forme mutée du récepteur humain. kinnara 100 µL Mitra 10 µL Vm 28 18 nmol.mn-1 Km 15 8 µmol.L-1 2.3.5 activité 28 000 18 000 UE UE.mL-1 activité 28 000 18 000 UE Vm en µmol.mn-1 Vm / vol fraction (en mL) Formuler deux hypothèses pouvant expliquer les résultats observés. Le récepteur est muté et est moins efficace. La cellule possède un inhibiteur.

14 2.4.1 2. Le petit peuple. 2.4. Effecteurs. 2.3. Iso-enzymes.
Quel est l'effet attendu de l'ADP sur l'activité enzymatique? 2.4. Effecteurs. 2.3. Iso-enzymes. Calculer les paramètres enzymatiques de ces expériences. L'ADP est un produit des réactions de phosphorylation qui utilisent l'ATP. Effet inhibiteur. 2.4.1 [ADP] en µmol.L-1 15 35 50 70 [peptide] V de phosphorylation en nmol.L-1mn-1 0,0 10 7,0 4,7 3,7 2,9 8,8 5,8 20 10,0 6,7 5,3 4,2 30 11,7 7,8 6,2 4,9 VmI 17,5 11,8 9,3 7,4 Km 15,0 15,1 En nmol.L-1mn-1 En µmol.L-1

15 2.4.1 2. Le petit peuple. 2.4. Effecteurs. 2.4.3. Tracer le graphe:
1 / (Vm-VmI) = f ( 1/ADP ) Quel est l'effet attendu de l'ADP sur l'activité enzymatique? 2.4. Effecteurs. En déduire la constante d'affinité de l'ADP sur l'enzyme. Calculer les paramètres enzymatiques de ces expériences. L'ADP est un produit des réactions de phosphorylation qui utilisent l'ATP. Effet inhibiteur. Peut-on parler d'effecteur enzymatique? Si oui, de quel type? 2.4.1 [ADP] en µmol.L-1 15 35 50 70 [peptide] V de phosphorylation en nmol.L-1mn-1 0,0 10 7,0 4,7 3,7 2,9 8,8 5,8 20 10,0 6,7 5,3 4,2 30 11,7 7,8 6,2 4,9 Ki = a/b = 25,4 µmol.L-1 Comme nous l'avons vu, NAD est un produit de la réaction et ne peut pas être considéré comme un effecteur à part entière. Vm = 28 nmol.L-1mn-1 VmI 17,5 11,8 9,3 7,4 Km 15,0 15,1 En nmol.L-1mn-1 En µmol.L-1