Flétrissement et bactériose vasculaire sur tomate - mise en évidence d’un complexe bactérien induisant des symptômes semblables à l’agent Ralstonia solanacearum.

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1 Flétrissement et bactériose vasculaire sur tomate - mise en évidence d’un complexe bactérien induisant des symptômes semblables à l’agent Ralstonia solanacearum Bastien Cochard, Romain Chablais & François Lefort. Groupe Plantes et pathogènes, Institut Terre Nature et Environnement, hepia, HES-SO//Genève 150 route de Presinge, 1254 Jussy, Suisse. Début 2017, des échantillons de tiges de tomate provenant d’un groupe maraîcher basé à Saint-Louis au Sénégal et présentant des symptômes avancés de bactériose vasculaire, furent analysés afin de vérifier la présence de Ralstonia solanacearum, Résultats Les symptômes observés orientaient le diagnostic vers Ralstonia solanacearum, mais après identification, aucune bactérie isolée n’appartenait ni au genre, ni à cette espèce. Cependant une part très importante da la flore bactérienne endophyte isolée (50 à 95% selon les échantillons), résistante à la pénicilline appartenait à la classe des Gammaproteobacteria. Certaines bactéries isolées sont connues comme pathogène chez l’homme (ex: Klebsiella sp. et Pseudomonas aeruginosa). Une majorité sont des bactéries fécales et ou saprophyte d’origine animale et humaine (ex: Enterobacter cloacae, Acinetobacter sp.). Le champignon Fusarium oxysporum, pathogène racinaire de nombreuses plantes, dont la tomate a été isolé. Pourtant les symptômes caractéristiques de ce pathogène ne correspondent pas à ceux observés. N° Isolat bactérien Identification séquence 16S Amorces 27 f / 1392 r Pourcentage d'identification 1 Enterobacter cloacae 99% 2 Pseudomonas sp. 100% 3 Staphylococcus sciuri 4 Pseudomonas aeruginosa 5 Acinetobacter sp. 6 7 8 9 Klebsiella sp. 10 11 12 13 Citrobacter sp. 14 Enterobacteriaceae bacterium 15 Pantoea sp. 78% 16 17 Stenotrophomonas sp. 18 19 20 Stenotrophomonas maltophilia 21 22 23 77% 24 Arthrobacter nicotianae 25 Enterobacter sp. 26 27 28 29 N° Isolat fongique Identification séquence ITS Amorces ITS 4/ ITS 5 30 Fusarium oxysporum principal agent du flétrissement et de la pourriture vasculaire sur tomate, également classé comme organisme de quarantaine par l’EPPO. Cette entreprise sénégalaise assure une production annuelle de 10'000 t de tomate cerise, sur une surface sous abris de 100ha. L’intégralité de la production est conditionnée et distribuée pour le marché européen durant la contre saison. Afin de déterminer l’agent responsable de cette bactériose, une analyse microbiologique puis moléculaire de chaque isolat fut réalisée. Fig 1. Photographie satellite des zones de production maraichère. Source: B. Cochard. Fig 2. Photographie d’une section de tige présentant des symptômes d’obstruction du système vasculaire par un pue bactérien . Source: B. Cochard. Les résultats de séquençage n’ont pas permis déterminer la présence de Ralstonia solanacearum. Néanmoins, l’analyse met en évidence la présence d’une flore microbiologique endophyte atypique composée de bactéries potentiellement d’origine fécale humaine ou animale Matériel et méthodes Echantillonnage, désinfection et isolement des microorganismes Tige tomate 1 (T1) Tab 1: Liste exhaustive de l’ensemble des microorganismes isolés. Source : B. Cochard. A B C D Echantillonnage: prélèvement de section de tige d’une longueur de + ou - 10cm sur des individus présentant des symptômes de flétrissement. Désinfection: stérilisation de surface à l’hypochlorite de sodium (concentration 2.6%) durant 10 min suivie de deux rinçages successifs à l’eau distillée stérile. Préparation des échantillons: Découpe de fragment de tige d’environ cm de côté dans la zone symptomatique et en périphérie de cette zone. Mise en culture (incubation: 48 à 72h à 28°C) : Potato Dextrose Agar (PGA) + Ampicilline (200 mg.L-1). Luria-Bertani Agar (LBA) + pénicilline. Bouillon Luria-Bertani (LBB) + pénicilline. Culture axénique: chaque micro-organisme est isolé séparément jusqu’à l’obtention de cultures pures sur PGA (champignon) ou LBA (bactérie). En comparant l’abondance relative de chaque souche sur l’ensemble des échantillons (tige et pus bactérien), deux genres bactériens sont clairement prédominants. Il s’agit d’Enterobacter et de Pseudomonas. Pour le premier, deux espèces sont majoritaires, Enterobacter cloacae (20% pour T1; 29% pour T2 et 33% pour Pb) et Enterobacter sp. (20% pour T1; et 17% pour Pb) En Ce qui concerne le genre Pseudomonas, l’espèces principale (retrouvé uniquement dans les échantillons de tige) est Pseudomonas sp (27% pour T1 et 22% pour T2). Fig 4: Abondance relative de la flore microbienne isolé de zone symptomatique sur tomate (T1). Source : B. Cochard. Fig 5: Abondance relative de la flore microbienne isolé de zone symptomatique sur tomate (T2). Source : B. Cochard. Fig 6: Abondance relative de la flore microbienne isolé du pue bactérien (Pb). Source : B. Cochard. Conclusion L’analyse moléculaire des microorganismes isolés des différents échantillons n’a pas mis en évidence la présence de Ralstonia solanacearum, ni permis de déterminer précisément l’origine du dépérissement des plantes. La saturation du substrat par des particules organiques et minérales, induisant la formation d’une zone anaérobique néfaste pour le système racinaire et l’apparition d’infections due à un complexe bactérien pathogène opportunistes semble être l’hypothèse la plus probable pour expliquer les symptômes de flétrissements et de bactériose vasculaire semblables à ceux causés par Ralstonia solanacearum, observés dans cette culture de tomate. Cependant, la flore microbienne atypique isolée en présence de pénicilline et donc résistante à la pénicilline met en évidence une flore endophyte inattendue, composée de nombreuses espèces de bactéries fécales humaines ou animales. La présence de ces bactéries est peut-être due à une eau d’irrigation contaminée, non filtrée. La présence de telles bactéries endophytes pose des questions sur la qualité sanitaire des tomates produites et sur l’impact des ces bactéries sur le microbiote des consommateurs. Fig 3 : (A) lots de tige de tomate 1 et 2 analysés. (B -C) Mise en culture des échantillons sur PGA. (D) Culture bactérienne axénique sur LBA. Source : B. Cochard. Identification moléculaire Afin déterminer l’identité génétique des différents microorganismes isolés, une extraction d’ADN est réalisée à partir de cultures pures liquides de ces microorganismes. Pour chaque isolat, une séquence de l’ADN ribosomal est amplifiée, avec les amorces ITS4 - ITS5 (champignon) et 27F -1392R (bactérie) et ensuite séquencée. L’ensemble des séquences sont comparées à la banque de donnée internationale NCBI (National Center for Biotechnology Information) à l’aide de l’algorithme BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). JOURNEES D'AUTOMNE SGP / SSP 2017 Diagnostique en phytiatrie: clé du succès en protection des plantes? 8-9 septembre 2017, hepia, Genève