1ére Journée « Biologie des systèmes » de l’université René Descartes

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1 1ére Journée « Biologie des systèmes » de l’université René Descartes
F. Letourneur / N. Cagnard Plate forme séquençage et génomique de l’Institut Cochin Implantation et utilisation de l’analyse du transcriptome : l’expérience de l’Institut Cochin Bonjour Cette première présentation va être originale pour 2 raisons : la première est qu’elle vous sera co-présentée par moi-même et par Nicolas Cagnard, l’ingénieur bio informaticien de la plate forme. La seconde est que nous serons sans doute les seuls a ne pas vous parler directement de biologie des systèmes. Nous travaillons tous deux sur la plate forme génomique de l’Institut Cochin et sommes venus vous présenter notre expérience locale de la mise en place d’une activité microarray, ses buts, ses difficultés et ses premiers résultats. Je vais vous présenter l’historique de l’implantation de cette activité et son évolution depuis 2 ans. Nicolas présentera, lui, son expérience de l’ analyse du transcriptome a la suite des différents projets réalisés sur la plate forme.

2 L’Institut Cochin 40 équipes de recherches 15 plateaux techniques
PF séquençage et génomique : Séquençage et génotypage / PCRq temps réel / microarray Audit : demande d’une activité microarray : ARN Analyse des données Collaboration équipe G. Chiocchia / PF Bilan audit : - Compétences bio informatiques et statistiques - Premières mauvaises expériences… Brièvement, l’Institut Cochin est une unité mixte INSERM CNRS de 600 personnes composé de 40 équipes de recherches travaillant dans des domaines aussi variés que l’étude des voies de signalisation, des mécanismes de la tumorigénèse, de l’inflammation ou du retard mental. Une quinzaine de plateaux techniques (microscopie confocale, recombinaison homologue, cytométrie,…) complètent l’organigramme. Notre plate forme séquençage et génomique apportent des solutions a nos équipes en terme - De séquençage et de génotypage moyen débit ( séquences faites en 2005) depuis 10 ans - De PCR q temps réel depuis 6 ans - De microarray depuis 2 ans environ Cette dernière activité a été mise en place pour répondre a des besoins croissants des équipes dans le domaine de la transcriptomique puis plus récemment dans celui du génotypage haut débit. Ces besoins ont été cernés par un audit réalisé courant 2004 : nous y avons identifiés une demande de mise à disposition sur la plate forme d’une activité microarray, regroupant toutes les étapes comprises entre ARN et analyse statistiques des données. Cette mise en place s’est faite en collaboration avec l’équipe de Gilles Chiocchia du département d’immunologie de l’institut. Pour toutes les équipes, les mêmes demandes : de compétences bioinformatiques pour manipuler des volumes de données très important, de compétences statistiques pour assurer des dessins expérimentaux cohérents avec les questions posés par les chercheurs et pour permettre des analyses statistiques robustes. Ces compétences très particulières sont encore absentes des laboratoires de recherche. Des projets mal dessinés, de qualité variable sont parfois inexploitables par les statisticiens.

3 Une plate forme micro array idéale…
intégration de compétences complémentaires Objectifs expérimentaux et contraintes? Population, Contrôles, Facteurs, échantillons Analyse fonctionnelle des données ???.. Conclusions biologiques ? Etude de pathways Modelisation protocole expérimental Analyse stat des données Une plate forme micro array est l’intégration de compétences complémentaires : un chercheur portant son projet spécialiste de son domaine, un biologiste spécialiste des différents outils de la plate forme , une équipe bio informatique – bio statistique proche des équipes. A chaque étape du projet, ces différents intervenants sont en étroite relation et exerce leur spécialité : La mise en place du projet va permettre de faire ressortir la question principale posée par le chercheur, de dessiner un protocole expérimental permettant d’y répondre (en particulier, aux questions suivantes : quel type de lame utilisée ? Combien ? Pour quel coût ? Qualité du matériel biologique ?). Cette mise en place est décidée de façon consensuelle par le trio. La plate forme va ensuite réalisée les expériences en suivant un protocole standard validé par tous. Lors du traitement du signal et de l’analyse statistique, c’est l’équipe bio info qui va prendre le relais en contact permanent avec le chercheur. L’analyse fonctionnelle des données obtenues est réalisée par la plate forme ou l’équipe de recherche en utilisant d’autres techniques, comme la PCR temps réel.. Notre expérience au cours de ces 2 années n’a fait que conforter ce schéma de fonctionnement idéal : c’est en faisant collaborer étroitement ces différentes compétences que l’on peut produire des lames et des données analysées de bonne qualité. En 2005, nous avons mis en place quelques projets pilotes en suivant cette organisation : Carlo Lucchesi, biostatisticien en CDD, a rejoint l’équipe a cette période et participé largement a la mise en place de l’activité, en collaboration avec Nicolas. Carlo a depuis lors rejoint l’institut Curie. Traitement signal Élimination des biais techniques Filtrage des données Normalisation du signal Hypothèses statistiques Tests paramétriques P values

4 2°/ Standardisation des expériences
Compétences biologistes Limiter les biais techniques 1°/ Contrôles qualité Bioanalyseur 2100 Nanodrop Four à hybridation RIN = ? 2°/ Standardisation des expériences La plate forme micro array regrouppe des compétences de biologistes et de bio informaticiens. Le travail essentiel réalisé par la plate forme est de limiter le plus possible les biais techniques nombreux liés a la technologie. Les moyens pour y parvenir sont variés : - Par l’instauration de contrôles qualité a toutes les étapes possibles a l’aide d’outils dédiés. Par exemple, le bioanalyseur acquis en 2004 nous permet d’estimer précisément la qualité du matériel biologique qui doit rentrer dans des manips de puces. Pour nos derniers projets, nous avons qualifiés nos ARNs par un indice qualité standardisé d’Agilent appelé RIN. Le nanodrop va permettre de doser précisément nos acides nucléiques, de contrôler les efficacités de marquage, d’éliminer des études ultérieures tout ce qui nous semble douteux techniquement. Par la standardisation des expériences de marquage, d’hybridation et de lavage par des protocoles validés sur d’autres plate formes (Agilent, Affymetrix) et par l’utilisation de lames de meilleure qualité, c’est-à-dire montrant une plus grande reproductibilité et qualité des spots : nous avons utilisés successivement des lames cDNA pour nos premières études et nous utilisons désormais des lames oligos longs. Nous avons observé, et Nicolas vous en parlera dans qqs minutes, des différences de qualité de lames qui ont des conséquences directes sur le dessin expérimental d’un projet. L’idée est en même temps de proposer l’accès a ces technologies a des coûts de moins en moins élevés. 3°/ Amélioration de la qualité des lames 2003 et 2004 : lames cDNA 2004 : lames oligo Agilent, RNG 2005 : chip Affymetrix

5 Compétences bio statistiques et bio informatiques
Le biostatisticien … Comprendre les questions posées par le biologiste, planification d’expériences, gestion de l’analyse statistique, interface entre cliniciens et mathématiciens, évolution vers l’intégration de données de transcriptome et de polymorphisme génétique, modélisation et biologie des systèmes Le bio informaticien … Applique la méthodologie statistique, utilise des outils de gestion de base de données, développe des applications pour les biologistes Une équipe bio informatique d’un institut de recherche doit avoir des compétences variées dans le domaine du micro array, de la protéomique, de l’association génétique, tout ce qui concerne les analyses haut débit. Une telle équipe a besoin de 2 pôles complémentaires : - un biostatisticien capable de planifier les expériences et de diriger l’analyse statistique des projets par le bioinfo, à l’interface du clinicien et du mathématicien, avec une évolution vers l’intégration de données de transcriptome et de polymorphisme génétique et vers la modélisation et la biologie des systèmes; - un bio informaticien chargé de la réalisation des études, par l’utilisation d’outils statistiques dédiés, chargé de la gestion des bases de données générées au cours de ces différentes études. Les outils utilisés par cette équipe sont des outils standards d’analyse statistique (R par exemple) et de recherche dans les bases de données (en particulier le logiciel genomatix distribué actuellement par le RNG). Actuellement, Nicolas s’occupe de la partie bio informatique mais n’a pas la formation ni encore l’expérience d’un statisticien. Il assure l’analyse statistique de base de nos données micro array. Outils d’analyse statistique standardisé : R, Genespring Outils de recherche dans les bases de données : Genomatix, pathway assist

6 Perspectives 2006 Structurer une équipe statutaire de bio info-bio stat en commun pour les équipes de Cochin et Necker : regroupement des compétences, des outils ; gestion et analyse de projets impliquant des données haut débit ; interface entre biologistes et mathématiciens. Bio informaticiens Les perspectives 2006 concernent la création d’une équipe bio informatique biostatistique commune aux sites de Cochin et necker : les besoins identifiés sur les 2 sites nécessitent la présence de bio informaticiens statutaires qui auront en charge les analyses des projets des équipes des 2 sites sous la direction d’un biostatisticien. Les postes de bio informaticiens devraient etre affichés aux concours CNRS et à l’INSERM cette année. Un poste de biostatisticien a été demandé cette année a l’université Paris 5. L’idée à la base de cette création est de regrouper les compétences et des outils coûteux, d’offrir aux équipes de recherche des 2 sites la possibilité de réaliser des projets haut débit. La fixation de ces activités permettra d’accueillir des étudiants ingénieurs bio informaticiens, servira d’interface avec des équipes de recherche de maths appliquées qui trouveront ainsi des interlocuteurs privilégiés. La présence de telles compétences au sein de l’université Paris 5 et leur volonté de travailler ensemble laissent penser que cette structure peut être à la base de nombreux travaux, en particulier dans le domaine de la biologie des systèmes. Le but est ici de générer des analyses de données valides et sures avant de les mettre à disposition de la communauté. Bio statisticien

7 Bilan d’une partie de l’activité depuis 2004
Études publiées - Syndrome de Sjogren / 40 lames cDNA / G. Chiocchia Activation of INF pathways and plasmacytoid dendritic cell recruitment in target organs of primary Sjogren’s syndrome - Gottenberg et al. PNAS USA 2006 feb 21, - Polyarthrite rhumatoide / 17 puces Affymetrix U133A2 / G. Chiocchia Interleukin 32, CCL2, PF4F1 and GFD10 are the only cytokine/chemokine genes diffrentially expressed by in vitro cultured rheumatoid and osteoarthritis fibroblast like synoviocytes – Cagnard et al. Eur Cytokine Netw 2005 dec;16 (4) : Étude non publiée : Comparaison de 2 types de lames oligo longs commerciales / 2 X 6 lames oligos Étude en cours d’analyse Tumeurs hépatiques mutées ou pas pour la voie Béta caténine / 18 lames Agilent 22k / C. Cavard Transcriptome de synoviocytes en culture transfectées par SiRNA / technologie Illumina Plus pratiquement, depuis 2004, le bilan est le suivant : Différents projets de recherche ont été publiés : Un projet d’étude, avec l’équipe de G. Chiocchia, du syndrome de Sjogren basé sur l’étude du transcriptome différentiel de tissus de glandes salivaires de patients souffrant du syndrome de Sjogren primaire et de patients sains. Nous avons mis en évidence l’importance de la voie interféron et de la cellule dendritique plasmacytoide dans la physiopathologie de ce syndrome auto immun. Un projet d’étude du transcriptome différentiel de synoviocytes issus de patients atteints de polyarthrite rhumatoide et de patients atteints d’arthrose, mettant en évidence 3 nouvelles chemokines associées a la PR, ouvrant ainsi de nouvelles voies dans la compréhension de la pathologie. Nous avons effectués une comparaison de 2 types de lames oligos longs afin de déterminer la plus intéressante et de valider et automatiser nos analyses statistiques de ce type de lame. En cours d’analyse actuellement, nous avons un projet d’étude du transcriptome différentiel de tissus hépatiques tumoraux, mutés ou pas pour la voie Béta caténine. Nous étudions également les effets induits par la transfection de SiRNA d’un facteur de transcription étudié dans la PR. Cette étude est faite avec la technologie Illumina.

8 Plate-forme = collaboration
Biologistes Biostatisticien Bioinformaticien Comme l’a montré franck, l’activité de plate-forme microarray est étroite une collaboration entre une équipe bioinformatique composé d’un biostatisticien et d’un bioinformaticien et d’une équipe de biologistes. De la même manière que l’équipe de biologistes le bio informaticien et le bio statisticien ont des rôles et des compétences complémentaires et bien définies au cours d’une étude de puces à ADN. La collaboration entre biologistes et bioinformaticien est nécessaire à plusieurs niveaux.

9 Phases d’interactions
Expérience microarray Analyse statistique des échantillons, matériel biologique Pré analyse Type de microarray Echantillons (pré analyse) Questions biologiques Analyse statistique Plan expérimental Questions biologiques Matériel (Puces, échantillons) Résultats pré analyse Caractéristiques statistiques Recherche de pathways GO Etc… Interprétations J’ai représenté ici les principales phases d’interaction d’une analyse microarray. Une étape de pré analyse qui estime les caractéristiques statistiques du matériel biologique Cette étape est surtout nécessaire dans le cas de maladies hétérogènes et les étude de tissus qui présentent une importante variabilité statistique des mesures. La mise en place d’un plan expérimental qui est une recherche d’équilibre entre les questions biologiques et le matériel disponible. L’équilibre est dicté par les caractéristiques statistiques résultats de la pré analyse. Vient ensuite l’expérience microarray et l’analyse statistique Le plan d’analyse dépend du plan expérimental, du type de puces, des résultats de la pré analyse et surtout des question biologiques posées.

10 Activité bioinformatique / puces à ADN
Équipe (Chiocchia – Bréban Institut Cochin) Mise en place et gestion d’une BDD clinique et biologique Études microarray Développement d’outils Plate-forme microarray Services: Analyse & interprétation (Pré analyses, plan expérimentaux) Mise en place de la plate-forme: Outils d’analyse qualité lame/signal Automatisation d’analyse et suivi des données (MIAME) Test / choix du type de puces Le coté analyse de la plate forme se résume pour l’instant une activité d’analyse que j’assure à temps partiel. Mon travaille se partage entre l’équipe et la plate forme Outils d’analyse indispensable pour gérer différents types de puces qui impliquent des technologies différentes et donc des analyses et outils d’analyse très différents

11 Outils analyse / interprétation
Analyse statistique Puces ADNc, Oligos (Agilent), Illumina Genespring R Puces Affymetrix dChip Array assist Interprétation Pathway assist Genomatix BDD Internet

12 Qualité / annotations des puces
Lames cDNA ~8000 sondes Étude tissus Arthrose vs Polyarthrite Rhumatoïde Points faibles: Annotations des sondes Bruit de fond technique Bruit de fond biologique Réplicats / dye-swap indispensables Solution: Technologie industrielle Annotations, mises à jour fréquentes Agilent Academic %flag %sat %bg 10 20 30 40 50 60 70 Difficultés rencontrées et solutions mises en places illustrées par plusieurs analyses type Devauchelle V. & al. Genes Immun Dec.

13 Compétence biostatistique
Lames cDNA ~8000 sondes Étude tissus de glandes salivaires de patients souffrant du syndrome de Sjögren Difficultés: Importante variabilité biologique Hétérogénéité des patients Solutions: Expertise bio statistique Méthodes statistiques adaptées (cas par cas) Gottenberg JE. & al. Proc Natl Acad Sci Feb 21

14 Technologies différentes
Lames affymetrix U133A2plus Étude synoviocytes issus de cultures Arthrose vs Polyarthrite Rhumatoïde Adaptation aux différentes technologies: Méthodes de normalisation / analyse Outils et méthodes statistiques Logiciels spécifiques Solutions: Outils standards polyvalents, paramétrables (R) Interactions biostatistitiens - bioinformatitiens Interactions biostatistitiens – bioinformatitiens de façon à mettre au point les plan d’analyses et les outils adaptés à de nouvelles technologies Cagnard N & al. Eur Cytokine Netw Dec.

15 Autour des puces Stockage des informations MIAME
& gestion de données de puces Types d’échantillons … Protocoles, méthodes d’analyse statistique Données brutes, normalisées Méta analyses Traçabilité des échantillons, réactifs, diagnostics, puces, analyses