dans le diagnostic de la tuberculose

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1 dans le diagnostic de la tuberculose
Place du laboratoire de Bactériologie dans le diagnostic de la tuberculose G. LAURANS C.H.U. AMIENS

2 PLACE DU LABORATOIRE EN MYCOBACTERIOLOGIE Poser le diagnostic de mycobactériose Mettre en évidence les B.A.A.R. dans les produits pathologiques - Observer l’apparition d’une culture et identifier la mycobactérie - Réaliser éventuellement une amplification génique (PCR) Guider la thérapeutique - Réaliser l’étude de la sensibilité aux antibiotiques Réaliser des études épidémiologiques - Typage moléculaire par analyse du génome Surveiller le traitement et son efficacité - Recherche de la négativation des cultures 3 semaines après la primoculture.

3 - Quelques généralités sur les Mycobactéries
Diagnostic bactériologique de la tuberculose Les prélèvements Mise en évidence des mycobactéries Examen direct Culture Identification Méthodes traditionnelles Méthodes de biologie moléculaire Sensibilité aux antibiotiques Méthode des proportions Etat des lieux au CHU d’Amiens ( )

4 LES MYCOBACTERIES Mycobacteriaceae 1 seul genre  Mycobacterium
- Paroi très riche en lipides  imperméable aux colorants usuels  fixe intensément les colorants alcalins (fuschine basique)  s’oppose à la décoloration par un mélange acide + alcool (= Bacilles acido-alcoolo-résistants) BAAR Cf Coloration de Ziehl-Neelsen Résiste aux agents chimiques alcalis (Soude) acide (Ac. Sulfurique) détergents (Lauryl sulfate de Na) Cf décontamination-fluidification des prélèvements contaminés Sensibilité particulière aux antibiotiques

5 Actinomycetales Famille Mycobacteriaceae Actinomycetaceae
Streptomycetaceae Genre Mycobacterium Nocardia Actinomyces Streptomyces Complexe tuberculosis Mycobacteries opportunistes Espèces M. leprae

6 Le genre Mycobacterium peut être subdivisé
en 3 groupes : « Complexe tuberculosis » M. tuberculosis M. bovis et BCG M. africanum … (Homme – Animaux) Mycobactéries « atypiques » (environnementales autres que tuberculeuses non tuberculeuses (MNT) opportunistes) M. xenopi M. avium-intracellulare M. kansasii M. szulgai M. chelonae-abscessus ……… Eau Terre Animaux Homme M. leprae

7 M. tuberculosis Très majoritairement responsable de la tuberculose chez l’homme Découvert en 1882 par Robert Koch  Bacille de Koch (B.K.) Plus rarement en cause M. bovis M. africanum La symptomatologie clinique est identique Seule l ’identification biochimique précise les différencie

8 Propriétés physiologiques particulières
* Bactérie exigeante en culture Nombreux facteurs de croissance nécessaires * Temps de division élevé (20 h)  lenteur de croissance environ 3 semaines sur milieu solide environ j en milieu liquide  particularités du traitement (6 mois) mais 1 seule administration quotidienne des antibiotiques sera suffisante  délai important entre contamination et apparition des signes cliniques = difficulté de l’enquête épidémiologique * Germe aérophile  localisation pulmonaire préférentielle * Nombre de mutants résistants aux antibiotiques relativement élevé parmi les souches sauvages (10-5 à 10-8 selon les antibiotiques)

9 Diagnostic bactériologique
Les prélèvements La probabilité de mettre en évidence des mycobactéries dépend de : - la qualité - la répétition des prélèvements - la rapidité de leur transport jusqu’au laboratoire Prélèvements d’origine pulmonaire - Crachats émission spontanée après un effort de toux de préférence le matin au réveil (3 jours de suite) - Tubages gastriques - Prélèvements sous fibroscopie Aspiration bronchique Lavage broncho-alvéolaire

10 Prélèvements extra-pulmonaires
- Urines ml minimum (3 jours de suite) émises au lever Vérifier la présence d’une leucocyturie et l’absence de bactériurie à germes banals - Abcès (prélèvement à la seringue) Transvaser dans un tube sec stérile éviter les écouvillons - Lésions cutanées (Biopsie) - Tissus divers - Liquides d’épanchement Les liquides séro-fibrineux seront prélevés sur anticoagulant Liquide pleural Liquide d’ascite au moins 10 ml Liquide articulaire LCR (au moins 2 ml) - Sang (Immuno-déprimés) - Moelle osseuse (sur anticoagulant)

11 Fluidification-Décontamination
Prélèvement Fluidification-Décontamination Centrifugation Culot Frottis Coloration Ziehl Auramine Culture Amplification génique

12 METHODES TRADITIONNELLES
a) Examen microscopique Frottis du produit pathologique ou du culot de centrifugation obtenu après fluidification- décontamination des produits pathologiques contaminés Ziehl-Neelsen (x 100) - Auramine (x 25)

13 Résultats Ziehl : méthode facile, bon marché, rapide • Sensibilité : environ 104 bacilles/ml = peu sensible dépend de l’extension des lésions (aussi du prélèvement) • Spécificité :  BAAR ne différencie pas les MT des MNT Signe la contagiosité du malade ne présume en rien du caractère viable ou non des bacilles

14 b- Culture : Après fluidification-décontamination Milieux de culture  M. solides à l’œuf - Lowenstein-Jensen - Coletsos  M. liquides (  M. d’enrichissement ) 7H9  MGIT – MB/bact – MB redox Bactalert (doit être couplé à 1 milieu solide) Résultats : Temps de détection M. solides à l’œuf j M. liquides Si Ziehl +  12 j Si Ziehl –  18 j Les 2 types de milieux sont complémentaires La sensibilité du résultat final est améliorée

15 c) Identification des mycobactéries :
 Vérifier l'AAR  Ziehl observer la morphologie du bacille  Orientation (sur milieu solide) Aspect des colonies lisses – rugueuses Forme Couleur achromogènes photochromogènes scotochromogènes Temps d'apparition M. tuberculosis j M. bovis  40 j M. africanum 60 à 90 j M. tuberculosis M. bovis

16  Tests biochimiques et culturaux
L'identification repose sur les caractères culturaux et les caractères biochimiques Niacine Nitrate-réductase Thermosensibilité de la catalase … Sensibilité au TCH Température de croissance Epreuve de photo induction M. tuberculosis Rugueux 15-20 + R M. africanum Mates 30-60 - (+) S M. bovis Lisse 30-60 - S Rugueux 15-20 - S BCG Aspect Délais Niacine Nitrate réductase TCH

17 Sensibilité aux antibiotiques
Toute souche sauvage dès que la population est importante (caverne  109 bacilles/ml)  mutants résistants fréquence varie en fonction de l’AB 10-6 INH 10-7 Rifampicine Traitement antituberculeux = Association de plusieurs médicaments pour éliminer ces mutants. Mais Si traitement mal conduit Ou mauvaise compliance des patients  Risque de sélection de souches résistantes à 1 ou plusieurs AB Souche R à INH et Rifampicine = souche multirésistante

18 Etude de la sensibilité aux antibiotiques
= systématique pour toute souche isolée chez un nouveau malade Ou si isolée à nouveau après 3 mois de traitement AB de 1e intention INH Rifampicine Ethambutol Streptomycine Pyrazinamide = 1e intention mais test in vitro non performant (activité en milieu H+) Si multirésistance détectée AB de 2e intention Ethionamide Amikacine  Ofloxacine Levofloxacine Moxifloxacine

19 Etude de la sensibilité aux antibiotiques
 Méthode des proportions (m. solide) évalue, au sein de la souche à étudier, la proportion de mutants qu’elle contient, en la comparant à la proportion critique - Connaître le nombre total de bactéries viables (témoins sans antibiotique) - Connaître le nombre de bactéries résistantes sur les milieux contenant les concentrations critiques d'antibiotiques Résultats : Si proportion de mutants < proportion critique = souche sensible > proportion critique = souche résistante Délai : 3 à 6 semaines

20 CONCLUSION Par les méthodes traditionnelles le diagnostic de la tuberculose est long Examen direct rapide manque de sensibilité manque de spécificité Culture Délais nécessaires mais Comment raccourcir ce délai ? Peut-on avoir plus rapidement la certitude que l'on est en présence d'une mycobactérie tuberculeuse ?

21 Mycobactéries tuberculeuses et opportunistes CHU Amiens (1995-2004)
Année n = nb d’examens demandés Mycobactéries autres que tuberculeuses (pulmonaires) Complexe tuberculosis Mycobacterium Mycobacterium tuberculosis bovis africanum avium xenopi autres 1995 n = 4285 1996 n = 5560 1997 n = 4600 1998 n = 4671 1999 n = 4353 2000 n = 3923 2001 n = 3222 2002 n = 3741 2003 n = 3916 2004 n = 3435 30 33 27 25 22 21 32 28 3 - 1 1 - 2 4 1 2 3 - 1 2 + (1) 1 + (1) (1) 1 M. kansasii - 1 M. abscessus

22 Mycobacterium tuberculosis Etat de la résistance aux antituberculeux
CHU Amiens ( ) M. tuberculosis = n Pays d’origine des patients Année Résistance n 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 30 33 27 25 22 20 31 28 INH INH + STR - STR INH + RIF + STR 1 - 2 Cambodge Maroc Cap vert - France – Maroc France – Cap Vert Liban Lettonie Ethiopie – Algérie France Congo INH = Isoniazide STR = Streptomycine RIF = Rifampicine