Méthodes d’étude de la localisation subcellulaire d’une protéine

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1 Méthodes d’étude de la localisation subcellulaire d’une protéine
Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de l’ADN dans des cellules végétales de tabac. (d’après Inserm)

2 I Localisation subcellulaire d’une protéine par observation au microscope électronique à transmission 1) L’autoradiographie Un atome radioactif se trouve incorporé dans une protéine de la cellule et sert de traceur (marquage au tritium le plus souvent). La détection de la radioactivité incorporée se fait ensuite par l’application d’une émulsion photographique sur la coupe: le rayonnement émis par les atomes radioactifs impressionne l’émulsion qui est alors révélée comme un film photographique. Les grains d’argent métallique sont localisés au dessus des structures ayant incorporé les atomes radioactifs.

3 Expérience de Jamieson et Palade Suivi à la leucine tritiée, grains de zymogène radioactifs.
3 minutes: grains d’argent sur le RE 20 minutes: grains d’argent sur l’appareil de Golgi 90 minutes: grains d’argent sur les vésicules sécrétrices Figure 2: Suivi de l’exocytose des grains de zymogène. (d’après le Alberts)

4 2) La cytoenzymologie Localisation d’une enzyme à l’échelle subcellulaire via la visualisation des produits de la réaction qu’elle catalyse. 3) L’immunocytochimie Localisation de l’anticorps spécifique d’une protéine donnée par couplage à une molécule opaque aux électrons: une bille d’or. (localisation par immunogold).

5 II Localisation subcellulaire d’une protéine via la fluorescence
L’immunofluorescence Localisation de l’anticorps spécifique de la protéine, donc localisation de la protéine. Obtention des anticorps spécifiques par injection de la protéine donnée à un lapins et récupération et purification des anticorps alors produits. Couplage des anticorps à un fluorophore pour observation au microscope confocal (couplage à l’anticorps primaire ou à un anticorps secondaire).

6 Localisation des microtubules
Les microtubules du cytosquelette sont mis en évidence grâce à un anticorps dirigé contre la tubuline. Le protocole d’immunofluorescence a comporté deux étapes : - reconnaissance de la tubuline par un anticorps anti-tubuline (anticorps 1) - repérage par un deuxième anticorps fluorescent dirigé contre l’anticorps 1 Figure 3: Observation au microscope confocal de microtubules (CNRS)

7 2)Localisation via la GFP
Emission de fluorescence à partir d’un ADN recombinant: promoteur du gène suivi de la séquence codante du gène sans son codon stop directement suivi de la séquence codante du gène de méduse Aequorea victoria codant la GFP. Transcription et traduction classique aboutissant à une protéine fonctionnelle à laquelle est fusionnée la GFP.

8 Les microtubules sont associés à la GFP et les histones 2b sont associés à la RFP.
Figure 4: Cellule souche mésenchymateuse observée au microscope confocal

9 III Avantages et inconvénients
Autoradiographie: nécessité de fixer les cellules, pas de vision en dynamique. Immunofluorescence indirecte: observation de la cellule en dynamique, et phénomène d’amplification du signal possible. Mais appréciation de la fluorescence subjective. Par la GFP, localisation in vivo des protéine, patron d’expression du gène dans le temps et l’espace… Mais recombinaison pas toujours efficace.