Master 1: 13 Avril 2011 Immunité cellulaire: Exploration.

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1 Master 1: 13 Avril 2011 Immunité cellulaire: Exploration

2 Cellules Immunocompétentes
Moelle osseuse Sang Progéniteur Granulocytes Monocytes Polynucléaires PN/PE/PB Monocytes Macrophages Dendritiques Lymphocytes B Lymphocytes T Cellules NK CS myéloïde CS Hématopoïétique CS lymphoïde

3 Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire
Objectifs Diagnostic des déficits immunitaires primitifs Caractérisation et suivi des déficits immunitaires secondaires Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire

4 Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire
Le lymphocyte Elément clé dans la réponse immune adaptative L’étude des lymphocytes permet l’identification et la séparation de sous populations fonctionnellement distinctes Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire

5 Sources de lymphocytes
Sang veineux périphérique +++ Les lymphocytes peuvent être étudiés après lyse des globules ou Les lymphocytes sont isolés par centrifugation sur gradient de ficoll Seuls les lymphocytes recirculants sont accessibles

6 Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire
Gradient de ficoll Exploration de l ’immunite à médiation cellulaire

7 Sources de lymphocytes
Organes lymphoïdes (Animaux d ’expérience, occasionnellement chez l ’homme) Rate Thymus Ganglion lymphoïde Tissu lymphoïde associé à l ’intestin: GALT Tissu lymphoïde associé aux bronches: BALT Tissu lymphoïde associé aux muqueuses: MALT Autres: épithélium, réaction locale (ex: Synovie pour la PR)

8 Lymphocytes: Caractérisation dans le sang périphérique
Morphologie: Haut rapport nucléo-cytoplasmique Noyau à chromatine mottée 12 um Cytoplasme petit , basophile, quelques (peu) granulations azurophiles

9 Immunophénotypage lymphocytaire
Les cellules lymphoïdes portent sur leur membrane de nombreux antigènes Ces antigènes sont identifiables grâce à des anticorps monoclonaux Certains antigènes sont des marqueurs de différenciation

10 CMF: Définition La cytométrie en flux a une définition très large.
C ’est un système pour mesurer et analyser les signaux émis par des particules entraînées par un courant et examinées une par une à travers un faisceau de lumière.

11 La cytométrie en flux 3 exigences
Analyse individuelle des cellules comme au microscope Analyse rapide de très nombreuses cellules, ce qui permet d ’accroître la fiabilité statistique Analyse plus précise Chaque paramètre est quantifié avec précision Etude simultanée de plusieurs paramètres

12 Bases de la CMF La CMF analyse les interactions des cellules avec un faisceau de lumière (laser) Les signaux lumineux engendrés dépendent - De caractéristiques propres aux cellules - De la présence de marqueurs chimiques ayant réagit avec ces cellules

13 L’analyseur en cytométrie
Une source de lumière. Le ban optique permet de diriger et de focaliser le faisceau de lumière. Un système fluidique. Courants liquides pour entraîner et réguler le flot de particules afin de centrer les particules par rapport au faisceau lumineux. Un matériel électronique pour mesurer l ’intensité des signaux lumineux, enregistrer conserver et réinterpréter les informations, trier les cellules lorsqu ’un module trieur est associé à l ’analyseur. Un ordinateur pour analyser les signaux lumineux et les comparer entre eux.

14 Paramètres étudiés en CMF

15 Paramètres étudiés en CMF
Les lumières diffusées - forward scatter : FS - Side scatter : SS Les fluorescences

16 Paramètres étudiés en CMF

17 Répartition cellulaire en CMF

18 Les fluorescences en CMF
Grâce aux anticorps monoclonaux, il est possible de détecter à la surface des cellules (mais aussi dans le contenu cytoplasmique) la présence de marqueurs. Ces anticorps sont couplés à des substances fluorescentes, ce qui les rend détectables.

19 Histogramme monoparamétrique

20 Histogrammes biparamétriques

21 Histogrammes biparamétriques

22 Veine liquide d’entraînement
Tri cellulaire Laser Veine liquide d’entraînement - Plaques de déflexion + Tube de collecte Non sélectionnées

23 Caractérisation des cellules en cytométrie de flux
Les différentes populations cellulaires sont identifiées et distinguées au moyen d ’anticorps spécifiques de leurs molécules de surface. La CMF permet aussi de compter les cellules d’après leurs antigènes de surface Les lymphocytes T matures: CD2-CD3 Lymphocytes T auxiliaires: CD4 Lymphocytes T suppresseurs/cytotoxiques: CD8 Cellules NK: CD56-CD16 Lymphocytes B: CD19-CD20 Monocytes: CD14

24 Immunophénotypage 5 couleurs: CD45-CD3-CD4-CD8-CD20

25 Immunophénotypage 5 couleurs: CD45-CD2-CD56-CD19-CD3

26 Fénêtrage en CMF

27 Les antigènes de différenciation
De très nombreux anticorps ont été produits Certains reconnaissent la même molécule sans cependant être dirigés contre le même épitope Des ateliers internationaux (Workshop) ont permis de comparer ces Acs et de regrouper les Ags qu’ils reconnaissent en classe de différenciation (CD)

28 Marqueurs des lymphocytes T
Récepteur de l’Ag Marqueurs de lignée T Transduction du signal Liaison MHC II Liaison MHC I Co-activation/B7 Co-activation CD40 Récepteur à l’IL2 Molécules d’adhésion Marqueurs de différenciation TCR CD2, CD5, CD7 CD3 CD4 CD8 CD28 CD40L CD25 LFA1, ICAM-1 CD45 RA/RO

29 Marqueurs des lymphocytes B
BCR CD19, CD20 CD79a/CD79b CD21 CD22, CD72 CD40 CD80/86 Récepteur de l’Ag Marqueurs de lignée B Transduction du signal Récepteur C3d/EBV Molécules d’adhésion Co-activation /CD4OL Co-activation /CD28

30 Caractérisation des cellules en cytométrie de flux
Comparaison compartiment mémoire et naïf CD45RO/CD45RA, CD62L, CD27 Marqueurs d’activation (CD25, CD69) Cellules présentatrices (CP) : cellules dendritiques (CD myéloïdes et plasmacytoïdes), monocytes, lymphocytes B (CD11c/CD11b, CD123, DR, CD14, CD19)

31 Caractérisation fonctionnelle des lymphocytes
lymphocytes B naïfs (CD27 -, IgM +, IgD +) lymphocytes B mémoires (CD27 +, IgM - IgD -) lymphocytes B immatures (CD27 +, IgM +, IgD +) lymphocytes T régulateurs (CD4+, CD25+, FoxP3+)

32 Marqueurs des cellules NK
KIR, LIR, CD94 NKp44,46,30,NKG2D CD16 LFA-1, CD18/11, CD56 CD2 RIL2, RIL12, RIL15.. NK Récepteurs /CMH I Récepteurs de cytotoxicité Récepteur Fc IgG Molécules d’adhésion Co-activation Récepteurs de cytokines CD3-, CD56+et/ou CD16+

33 Compartiments cellulaires du système immunitaire
Seuls 2% des lymphocytes totaux se retrouvent dans le sang circulant. Les cellules recirculent en permanence des tissus lymphoïdes vers le sang, la lymphe puis retour aux organes lymphoïdes. La majorité des cellules se trouvent temporairement dans les organes lymphoïdes I (MO, thymus) ou II (rate, ganglion, plaque de Peyer) Les relations entre les taux de lymphocytes dans le sang et les différents tissus ne sont pas connues

34 Répartition tissulaire des lymphocytes
Lymphos T Lymphos B Cellules NK Sang périphérique 70-80% 10-15% Moelle osseuse 5-10% 80-90% Thymus 99% <1% Ganglion 20-30% Rate 30-40% 50-60% 1-5%

35 Méthodes de séparation des lymphocytes
FACS: “Fluorescence activated cell sorter “ Rosette E:Les cellules T se lient sélectivement à des globules rouges de mouton formant des rosettes.Une couronne de GR se forme autour des Lymphocytes T qui sédimentent et se séparent des autres cellules. Microbilles: Des microbilles magnétiques recouvertes d ’anticorps monoclonaux spécifiques d ’un marqueur membranaire sont mises en présence de la suspension cellulaire. Le tube est alors placé dans un champ magnétique puissant qui retient les billes et les cellules qui y sont attachées Paning ou élimination des cellules porteuses d ’un marqueur à l ’aide d ’Acs fixant le complément

36 Tri sur microbilles

37 Evaluation fonctionnelle des lymphocytes T Réactions d ’hypersensibilité retardée
Réactions d  ’HSR in vivo Test tuberculinique Test au DNCB

38 Intradermoréaction Lecture : taille de l’induration à 48-72 heures
Antigènes: Tuberculine Candidine Anatoxine tétanique Anatoxine diphtérique Trychophyton

39 Proliférations lymphocytaires
Au cours de la réponse adaptative , des lymphocytes spécifiques de l’antigène vont proliférer avant de se différencier en cellules effectrices. La phase de prolifération est indispensable pour engendrer un nombre de cellules effectrices suffisant. A la différence de la plupart des autres cellules de l’organisme les lymphocytes n’atteignent le stade terminal de leur différenciation qu’après avoir été stimulés par un antigène

40 Proliférations lymphocytaires
Il est difficile de détecter la prolifération de lymphocytes normaux en réponse à un antigène spécifique , parce que seule une proportion très faible de ces cellules va être stimulée et se diviser. Certaines substances, les mitogènes induisent la prolifération de beaucoup de lymphocytes voir de tous Si la stimulation par les mitogènes est non spécifique, cependant elle déclenche une réponse cellulaire identique à la réponse observée en cas de stimulation antigénique

41 Les mitogènes La plupart des mitogènes polyclonaux sont des lectines d’origine végétale ou animale. Ils sont très utiles pour étudier la capacité des lymphocytes à répondre à un stimulus non spécifique. Certaines lectines peuvent présenter une certaine spécificité à l’égard d’un type cellulaire

42 Mitogènes non spécifiques
Concanavalline A: ConA (T) Phytohémagglutine: PHA (T) Pokeweed mitogen: PWM (T et B) Extrait de Nocardia opaca: NWSM

43 Autres activateurs polyclonaux
Anticorps: Anti-cellules T: anti CD3 Anti-immunoglobulines Endotoxines bactériennes (B) Protéine A du staphylocoque (B) Sulfate de dextran (polysaccharide) Virus: EBV

44 Sélectivité des activateurs
La PHA (phytohémagglutinine A) et la ConA (concanavaline A) sont spécifiques des cellules T Les endotoxines activent électivement les lymphocytes B Le Pokeweed stimule à la fois les cellules T et les cellules B. L’activation des cellules B par les endotoxines et la protéine A du staphylocoque ne nécessite pas la présence de cellule T alors que celle induite par le pokeweed la requiert.

45 Proliférations lymphocytaires spécifiques
Réponse allogénique: la réaction lymphocytaire mixte: met en présence des cellules T répondantes et des cellules stimulantes irradiées Ne nécessite pas de préimmunisation Réponse antigénique après présensibilisation in vivo Vaccination antérieure Infection fréquente

46 Mise en évidence de l’activation
Observation des cellules au microscope Mesure de l’incorporation de précurseurs radiomarqués d’ADN (thymidine tritiée), d’ARN ou des protéines dont la synthèse est augmentée. Incorporation de BrdU Analyse du cycle cellulaire Diminution du CFSE

47 Le cycle cellulaire La phase G0 correspond à un état de repos.
Au cours de la phase G1 la cycle entre en cycle. La taille de la cellule augmente, ainsi que son contenu en ARN et en protéines. Au cours de la phase S la cellule synthétise de l’ADN La phase G2 précède le stade M qui correspond à la division de la cellule-mère

48 Fonction effectrice des LyT
La fonction effectrice des LyT peut être évaluée par le dosage de médiateurs tels que cytokines et cytotoxines Le dosage des cytokines peut être réalisé par ELISA sandwich ou test ELISPOT

49 Mesures de la production d ’interleukines
Méthodes: RIA ELISA Luminex CMF Elispot: sécrétion Effet biologique

50 Différenciation des lymphocytes T CD4+
TH0 IL-2 IL-4 IFNg TH2 IL-5 IL-6 IL-10 TH1 IFN g TNF b Lymphocytes T CD4 inflammatoires Lymphocytes T CD4 auxiliaires

51 Cytotoxicité non restreinte au CMH
Les cellules NK Morphologie: Lymphocyte de grande taille Phénotype: CD56+; CD57+; CD16+; CD3- Cible cellulaire:lignée K 562-

52 Etude des fonctions des cellules phagocytaires
Locomotion Capacité d ’ingestion Métabolisme oxydatif Bactéricidie Sécrétion de cytokines

53 Etude de l’adhérence Expression des molécules d’adhérence à la surface des PN Sang total à +4°C Etat de base + fMLP à 37°C Capacité de réponse des PN Ac anti-CD15, CD11b, CD18, CD62L Repos Stimulation

54 Etude du mouvement

55 Etude du contenu des granules
Morphologie: Aspect des PN sur frottis Mesure de la capacité à dégranuler après stimulation CMF: CD11b, CD35… ELISA: libération du contenu granulaire dans le milieu extracellulaire Histochimie: mesure des différents marqueurs des granulations granulations azurophiles: MPO granules spécifiques: CD11b granules sécrétoires: CD35

56 Etude de l’ingestion Adhérence de E.Coli à la surface des cellules phagocytaires : CMF Ingestion de levure: MO Ingestion de E. Coli opsonisées: CMF

57 Etude du métabolisme oxydatif
Activation des phagocytes par des stimuli Solubles: PMA, fMLP, endotoxine Particulaires: zymosan, bactéries opsonisées Mesure de la production globale des formes réactives de l’oxygène Réduction du cytochrome c: spectrophotométrie Chimioluminescence Evaluation du % des PN produisant des FRO Réduction cytochimique du NBT CMF

58 CONCLUSION: Applications futures
Ces nouveaux examens permettront d'améliorer la prise en charge de certaines pathologies: * La transplantation d'organe. Prévention du rejet Surveillance des traitements IS * Caratérisation des déficits immunitaires, MAI * Mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'induction de la tolérance * Cancers, maladies auto-immunes, maladies chroniques ou tout simplement dues au grand âge,

59 Merci pour votre attention….