Outils moléculaires dans le diagnostic, le traitement et l’épidémiologie des infections à mycobactéries Nicolas Veziris Alexandra Aubry Wladimir Sougakoff.

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1 Outils moléculaires dans le diagnostic, le traitement et l’épidémiologie des infections à mycobactéries Nicolas Veziris Alexandra Aubry Wladimir Sougakoff Chantal Truffot Vincent Jarlier CNR résistance des mycobactéries aux antituberculeux, Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris

2 Objectifs des outils moléculaires pour les mycobactéries
Identification des mycobactéries par analyse des séquences ADN/ARN : sondes... Recherche ADN/ARN mycobactérien dans les prélèvements pour le diagnostic : amplification génique (PCR...) Détection de la résistance aux antibiotiques : mise en évidence de mutations spécifiques Comparaison de souches (typage moléculaire) : empreinte digitale génomique

3 Identification moléculaire de l’espèce

4 Schéma classique d’identification
des principales mycobactéries atypiques (GBEA AZAY) 0,01 mg de la souche ensemencé sur 8 tubes de LJ* et 1 tube de GO subculture > 7 jours subculture < 7 jours croissance sur GO non pigmenté pigment + pigment- photochromogène complexe vaccae aurum NO3+ NO3- colonies ds colonies Es ou r bacilles courts EMB S NO3+ NO3- culture «30°° M.fortuitum M.chelonae EMB R TWH + Tb1 S Tb1 R NO3- TWH- M.kansasii M.marinum complexe terrae complexe aviaire scotochromogène Colonies ds Colonies Er Colonies Es Tb1 R NO3- GO + NO3- Tb1 R bacilles bacilles NO NO M.flavescens 3- 3- courts longs (Cul.à 42°C) M.gordonae M.szulgaï NO3 : nitrate réductase, TWH : hydrolyse tween 80 Tb1 S Tb1 R EMB : éthambutol (2 mg/l), Tb1 : thiacétazone 10mg/lt S : sensible ; R : résistant ; ds : dysgonique lisse M.scrofulaceum M.xenopi Er : eugonique rugueuse, es : eugo nique lisse * 1 tube de L-Jensen placé à 43°C, 1 à 30°C ; 2 à 37°C dont l'un est protégé de la lumière (papier arg enté); 3 LJ additionnés de 0,5 mg/l PAS ; 2 mg/l d'éthambutol (EMB) ; ou 1 0 mg/l de thiacétazone (Tb1).

5 Identification de l’espèce : analyse de séquences conservées d ’ADN
ex. ADN r16S, ADN r23S, hsp 65, rpoB, gyrA, gyrB,... banques de séquences d ’ADN PCR Culture Séquencage Comparaison de sequences Nom de l ’espèce 11

6 Identification de l’espèce : sondes ADN
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7 Identification de l’espèce : sondes ADN
Accuprobe® (Gen-Probe), extraction + luminomètre, ARNr : M.Tb complex, MAC, M.kansasii, M.gordonae INNO-LIPA mycobacteria (Innogenetics), PCR+ bandelette : ADN espace 16s-23s : 16 espèces (Mtb complex) Genotype mycobacterium (Hain Lifescience), PCR + bandelette : ADN 23s : 13 espèces (Mtb complex) Genotype MTBC (Hain Lifescience), PCR multiplex + bandelette : ADN 23s, RD1, gyrB : différencie les espèces au sein du complexe tuberculosis

8 au sein du complexe M. tuberculosis
Identification de l’espèce au sein du complexe M. tuberculosis M. tuberculosis ou M. canetti ou M. africanum II 2. M. africanum I 3. M. microti 4. M. bovis 5. M. bovis BCG 6. M. bovis caprae

9 Diagnostic moléculaire de l’infection

10 Amplification génique : Principes et étapes
Prélèvement PREPARATION Lyse bactérienne Acide nucléique cible = 1 copie Amorces Enzymes (polymérase, transcriptase, ligase...) AMPLIFICATION Amplicon = copies DETECTION Signal (RLU, DO......)

11 Tests d’amplification génique : techniques
Trousses commercialisées Techniques : PCR (Roche) , LCR (Abbott), TMA (GenProbe-bioMérieux), SDA (Becton) Automatisation pour certaines techniques Personnel très qualifié, organisation du laboratoire en plusieurs zones séparées, CQI très stricts

12 Principales techniques d ’amplification génique pour la détection de la présence d ’ADN/ARN de Mycobacterium tuberculosis

13 Objectifs, prérequis Diagnostic positif de Tb:
Sensibilité Valeur prédictive positive, qui dépend de : prévalence de la maladie vs. specificité Diagnostic d’élimination de Tb (screening) : Conséquences d’une erreur par défaut

14 Diagnostic des infections à mycobactéries au laboratoire de Bactériologie médicale Quelques chiffres (France/an) Environ cas de tuberculose documentés bactériologiquement % de prélèvements cultures + à Mtb : 5 % des prélevements respiratoires (1/2 M+), << 1% des prélevements de séreuses Répartition des cas de TB dans les laboratoires (réseau CNR ) de < 5 cas à > 100 cas par an 15 laboratoires : 50 à 100 cas TB /an médiane : 10 cas/an, soit < 1cas TB /mois De l’ordre de 500 cas de mycobacteriose hors SIDA (M. xenopi, kansasii, MAC, marinum, abscessus-chelonae, fortuitum...)

15 Tests d’amplification génique : performances
Sensibilité : % si M+, 50 % si M- Spécificité : 95-97% VPP : spécificité vs. prévalence Tb dans la population à laquelle on applique le test ; France : <5 % (LCR M-) à ~100 %(expectoration M+) VPN : bonne, ce qui est attendu pour maladie rare Voir par exemple méta-analyse par Sarmiento, JCM 2003

16 Valeurs prédictives des Tests d’aplification génique (TAG) pour le diagnostic de la tuberculose
Specimen Sensit. Specif. TB Prévalence VPP VPN Respiratoire M+ C+ 98% >90% Peu de MOTT 99% 90% M- C+ 50% 2 - 5% % % Non respir. M- C+ * < 50% < 1% <5% >99% M = microscope ; C = culture ; * = ex. LCR..

17 Amplification génique : indications pour le diagnostic bactériologique des infections à mycobactéries Seule indication : formes « Microscope + » Présence de b.a.a.r.   - Tuberculose pulmonaire active ou mycobacteriose ? (typage rapide) ATS 1997, AJRCCM 155: Pas d’indication pour : Tuberculoses extra-pulmonaires M- Primo-infections et séquelles de tuberculose mycobactérioses M-

18 Tests d’amplification génique : perspectives
Améliorer la sensibilité (volume soumis au test, méthodes d’amplification…) ? Améliorer la spécificité (systèmes « anti-contamination ») ? Augmenter la probabilité pré-test +++ pour les suspicions de formes respiratoires M- (10%) pour obtenir VPP acceptable (70%). Moyen = score composite clinique-radiologique-historique

19 Détection moléculaire de la résistance aux antibiotiques

20 Tests de résistance aux antibiotiques par biologie moléculaire
Réaliste et attractif pour antibiotiques pour lesquels ~ toutes les souches résistantes ont une mutation bien identifiée dans 1 seul gène, de préférence dans 1 portion limitée : Rifampicine (InnoLipaRifTB, commercialisé) Pyrazinamide Quinolones Pas réaliste sinon (isoniazide ……)

21 Intérêt pratique des méthodes génotypiques pour la détection de la résistance chez Mycobacterium tuberculosis a : marqueur de multirésistance (MDR) b : ++++ si MDR 18

22 Outils moléculaires pour la détection de la résistance aux antituberculeux
commence par une amplification génique puis : - analyse sans séquence des fragments amplifiés : SSCP, hétéroduplex, restriction... - hybridation avec des sondes oligonucléotidiques : bandelettes LiPA®, puces Genechip® - séquence nucléotidique : manuelle, séquenceur automatique 12

23 *numérotation des codons utilisée chez E.coli
Mécanisme de résistance à la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis Mutations ponctuelles dans la région * de rpoB, codant la sous-unité b de l’ARN polymérase 511 513 516 521 526 531 533 Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Pro Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Arg Leu Leu Trp Pro Pourcentage des mutations parmi souches Rif-R (Musser 1995) 10% 35% 45% *numérotation des codons utilisée chez E.coli

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26 Sensibilité et spécificité du test InnoLiPA RIF. TB® (Innogenetics)
S, sensible à la rifampicine; R, résistant à la rifampicine Rossau 97, Cooksey 97, Marttila 98, Matsiota 98, Watterson 98, Gamboa 98, Kiepela 98, Sintchenko 98, Gonzalez 99, Hirano 99, Traore 2000, Truffot 2002

27 GeneChip Probe Array This is a chip.

28 (Millions of identical probes/feature)
Chip Format 20µm 20µm (Millions of identical probes/feature) 1.28cm Today, 50 to 150 identical chips are manufactured at the same time on one unique wafer, using the same set of masks. Chips are available at different sizes, the most common one being 1.28 square cm. This chip can be divided in hundreds of thousands of different features. Each feature contains millions of identical probes. 1.28cm up to ~ 400,000 features/chip

29 Sequence Detection on High Density DNA Arrays
Oligonucleotide probes complementarity to DNA or RNA sequences A T C G CGTAAT FI This slides illustrates the basic principle of the detection on AFFX DNA probe arrays. DNA sequences are determined by hybridizing the nucleic acid target to large sets of oligonucleotides synthesized at precise locations on a glass substrate. The target has been previously labeled with a fluorophore and each signal measured on the glass surface means that the target has hybridized to its complementary sequence on the chip.

30 4L-Tiling Strategy for DNA Chips
5’ TGCACTTGACATAGGCTGT 3’ TGCACTTGAAATAGGCTGT 3’ TGCACTTGACATAGGCTGT 3’ TGCACTTGAGATAGGCTGT 3’ TGCACTTGAT ATAGGCTGT GCACTTGACATAGGCTGTA GCACTTGACCTAGGCTGTA GCACTTGACGTAGGCTGTA GCACTTGACTTAGGCTGTA Target Probes for base 1 for base 2 ~ 20mer probes with perfect and central mismatch at each base For every base within a given reference sequence, four probes of equal length are synthesized on the array. The interrogated base is centrally located within the probes, which also have common 3’ and 5’ termini. One probe is an exact complement to the reference sequence, while the three other probes represent the possible single base mismatches to the interrogated base. Base calls are determined by comparing the hybridization intensity of a labeled target to the four probes. This strategy is applied for every position analyzed in the target sequence. So a high number of specific, redundant and overlapping probes are built on the array, providing robustness to the assay. A CTTGA C AT A G GC T G T A Eliminate 3 weakest signals to call base A C G T

31 * * * * * * STEP 3: Hybridization and Scan Bacterial Nucleic acids
Hybridize target to probe array in GeneChip® Fluidics Station Scan hybridized array with HP GeneArray™ Scanner and view final data (GeneChip Sequence Analysis Window) Amplification Labeling

32 GeneChip - rifampicine (Biomérieux) Pilot study (Sougakoff et al
GeneChip - rifampicine (Biomérieux) Pilot study (Sougakoff et al. CMI 2004) Strains Mutation N yes no Rmp-S Rmp-R * 1 * mutations : Ser531 (n=36), His526 (n=16), Asp516 (n=4), Gln513 (n=1), délétion (n=1) Asp516+Gly523 (n=1)

33 Outils moléculaires pour la détection de la résistance aux antituberculeux : stratégie
1. Recherche de la résistance à la rifampicine InnoLiPA Rif.Tb® ou Hain Lifescience sur prélèvements M+ (à défaut sur cultures) si facteurs de risque de résistance : ATCD traitement, VIH+, Immigration récente d’un pays où Rif-R fréquent, prison... 2. En cas de résistance à la rifampicine Pyrazinamide : séquençage pncA Fluoroquinolones : séquençage gyrA

34 Mutations associées à la résistance aux antibiotiques chez les mycobactéries atypiques
Rifampicine et sulfamides pour M.leprae : mutations rpoB, folP) (Cole 1993, Cambau 2001, Cambau 2005) Clarithromycine pour MAC : mutations ARN23S en 2058 ou 2059 (Meier 1994) Clarithromycine pour M.abscessus / chelonae : mutations ARN 23S (Wallace 1996) fluoroquinolones pour M. fortuitum : mutations gyrA (Cambau 1996)

35 Marqueurs moléculaires

36 Marqueurs moléculaires (empreintes digitales génomiques) : bases de l’interprétation des résultats
Empreintes différentes = « souches différentes » : exclut un lien épidémiologique entre les cas. Empreintes identiques = « souches non différentes » (et non pas souches identiques) : n’exclut pas, mais ne prouve pas, un lien épidémiologique entre les cas.

37 Marqueurs moléculaires : techniques
RFLP : référence à ce jour Spoligotyping : bcp + commode, bcp - discriminant MIRU-VNRT : en cours d’évaluation (pourrait être aussi discriminant que RFLP ?) N.b. : pouvoir discriminant = aptitude à obtenir des empreintes digitales génomiques différentes pour des souches bactériennes de cas manifestement indépendants

38 Marqueurs moléculaires Nouvel épisode de tuberculose chez un même malade : réactivation endogène ou re-infection exogène ? Question lorsque les souches ne sont pas manifestement différentes sur des critères simples (espèces, résistance aux antibiotiques) « souches non différentes » = réactivation « souches différentes » = réinfection

39 Marqueurs moléculaires Transmission de la tuberculose dans les institutions/communautés fermées
Confirmation (ou infirmation) d’un lien épidémiologique suspecté sur l’histoire des cas : augmentation de la fréquence des cas (« épidémie de cas ») liens patents entre les cas : temporels, géographiques (ex. même famille, prison, foyer SDF ou migrants, hôpital …) sujets particulièrement réceptifs (VIH+, greffés…) souches ayant des caractéristiques phénotypiques identiques remarquables (ex. : MDR).

40 Marqueurs moléculaires Etude de la transmission de la tuberculose en « population entière »
Etude épidémiologique et microbiologiques : intérêt évident mais travail colossal La proportion de cas « bactériologiquement liés » pour lesquels on trouve un « lien épidémiologique » est faible (10 à 30 %)

41 Intégration des outils moléculaires dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose
Prélèvement Examen microscopique amplification génique M+ M0 Antibiogramme et culture Culture + - InnoLiPA Rif.TB C+ C+ Pas de mutation C0 mutation pncA, gyrA Empreint digitale génomique si le contexte épidémiologique suggère une transmission faire ATB « direct »

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43 Evolution du nombre d’ infections généralisées
à Mycobacterium avium CHU Pitié-Salpêtrière Nombre de cas/an 20 40 60 80 Total cas SIDA Trithérapie anti-VIH 100 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 86 85 84 83 82 81 80 1983 2000 Années

44 Classification des principales mycobactéries atypiques selon les groupes de Runyon et selon leur pouvoir pathogène _______________________________________________________________________ Groupe de Runyon Pathogène Non pathogène ou opportuniste* exceptionnellement ___________________________________________________________________ Groupe I. Photochromogènes M. kansasii M. marinum M. simiae Groupe II. Scotochromogènes M. xenopi M. gordonae M. szulgai M. flavescens M. scofulaceum Groupe III. Non chromogènes complexe avium Complexe terrae M. malmoënse M. gastri M. ulcerans M. haemophilum M. genavense Groupe IV. à croissance M.abscessus Complexe aurum rapide M. fortuitum M. peregrinum M. chelonae M. smegmatis * si coexistence des signes en faveur d'infection

45 Ieven and Goosens, Clinical Microbiology Reviews 1997
Performances de l’amplification génique dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose Ieven and Goosens, Clinical Microbiology Reviews 1997

46 Indications of DATs in TB diagnosis
Smear + specimens (typing) differentiate TB/MOTT ATS 1997, AJRCCM 155: Smear- : only if TB prevalence (pre-test probability) > 10%

47 Tests d’amplification génique : indications
Identification bacilles vus en microscopie (prélèvement M+) Pas pour diagnostic positif en cas de suspicion TB M- , en l’état actuel des choses, surtout pas pour les formes extra-respiratoires (ex. méningite) Pas pour diagnostic négatif en cas de suspicion TB M- formes extra-respiratoires graves paucibacillaire (ex. méningite)

48 Detection of an rpoB Mutant: His526Tyr
Probes for Wild-type Probes for Mutant His, codon 526 His, codon 526 Wild-type Target CAC Tyr, codon 526 Tyr, codon 526 Mutant Target TAC This slide illustrates the detection of the CAC®TAC point mutation responsible for the His526Tyr substitution is presented in Fig. 2. This mutation accounts for 30% of M. tuberculosis rifampin-resistant strains (12). Redundancy in the probes used in the sequence interrogation provides robustness for the test. The C®T change could be detected using either the probes specific for the mutation (Fig. 2 B) or the probes specific for the wild-type sequence (Fig. 2 A). At all positions interrogated by mutant-specific probes, the mutant target hybridized producing intensities that are roughly the same. However, intensities of the wild-type-specific probes are different for the same target. At the point mutation position, a single probe is perfectly complementary to the target and produces a relatively strong hybridization signal. At the neighboring positions, hybridization to the probes is reduced since there is a one-base mismatch with respect to the target sequence. The opposite experiment, hybridization of the M. tuberculosis rpoB wild-type target to the same probe tiles, is shown in Fig. 2 C and D. Hybridization signals to the wild-type C probes are clearly observed. The ability to detect a new point mutation not included in the array design was demonstrated for one isolate: the wild-type probes detected the mutation The ability of the probe array to detect new point mutations, neither previously described nor tiled on the array, by simply using the probes defined for the wild-type sequence. Thus, the efficiency of our probe array strategy should not be diminished by the occurrence of a new point mutation or polymorphisms not on the array.

49 RESULTATS (2) Analyse des souches de M.tuberculosis Rif R
Souche Rif CMI Rfp CMI Rbt PUCE/ Nbre séq.rpoB 35B R S531L 34 23B R S531W 2 3B R H526Y 5 8B R H526D 5 51B R H526L 4 33A R H526N 1 42B R H526R 1 4B R D516V 4 43A R Q513L 1 * Rfp, rifampicine; Rbt, rifabutine

50 Suspicion clinique de tuberculose
Rôle du laboratoire dans l’instauration du traitement de la tuberculose (M+) Traitement antituberculeux ? si urgence médicale Prélèvement Examen microscopique Traitement antituberculeux M présence de baar M0 absence de baar Vérification évolution adaptation Antibiogramme direct ATB 1ère ligne* culture Culture négative Culture positive Antibiogramme 2ème ligne si R INH ou RMP Identification Traitement antituberculeux Antibiogramme indirect ATTB 1ère ligne Traitement spécialisé Vérification évolution adaptation