Structure et Propriétés des enzymes

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1 Structure et Propriétés des enzymes
Enzymologie Générale Structure et Propriétés des enzymes

2 I. Généralités I.1. Définition Les enzymes sont des biocatalyseurs protéiques spécifiques qui accélèrent la vitesse des réactions chimiques se déroulant dans la cellule. Le pouvoir enzymatique est intimement lié à la structure tridimensionnelle de la protéine enzymatique, il est altéré quand cette dernière est modifiée.

3 I.2. Propriétés générales des enzymes
Les enzymes ne créent pas la réaction, elles la favorisent et sont complètement régénérées à la fin de celle là. La réaction est en général une rupture de liaison covalente Une formation de liaison de covalente Une association des deux.

4 Les enzymes abaissent l’énergie d’activation et augmentent la concentration des substrats à l’état activé. Les enzymes n’interviennent pas dans l’équilibre des réactions chimiques réversibles.

5 Les enzymes agissent à de très faibles concentrations, d’où la notion d’efficacité déterminée par l’activité moléculaire spécifique (AMS). L’activité moléculaire spécifique étant définie comme le nombre de molécules de substrats transformées par unité de temps et par molécule d’enzyme, lorsque cette dernière est le facteur limitant de la réaction : 103  AMS < 106.

6 Spécificité de fonction (6 classes d’enzymes)
Les enzymes sont spécifiques : Spécificité de fonction (6 classes d’enzymes) Spécificité de substrat (glucose oxydase) Spécificité optique (série D ou L des sucres et des AA) Spécificité d’organe soit mitochondrie (aminotransférases du cœur et du foie).

7 II. Nomenclature des enzymes
II.1. Conceptions anciennes Rajout du suffixe « ase » au nom de la substance à transformer Exemple : urée → ammoniac + CO2 (uréase).

8 Rajout du suffixe « ase » au type de réaction catalysée par l’enzyme.
Exemple : Urée + H2O → ammoniac + CO2 (hydrolase) Noms communs consacrées par l’usage Exemple : pepsine, trypsine…

9 II.1. Conceptions actuelles : Numéro d’ordre
Ensemble de 4 chiffres séparés par des points (UIB). Exemple : = alcool déshydrogénase.

10 la classe de l’enzyme. Le deuxième désigne la sous-classe de l’enzyme, c'est-à-dire le type de fonction du substrat participant à la réaction. Le troisième chiffre désigne la sous-sous-classe, donc la nature de l’accepteur. Le quatrième chiffre indique la place de l’enzyme particulière à nommer dans la sous-sous-classe.

11 Il existe 6 classes principales d’enzymes :
classe des oxydo-réductases classe des transférases classe des hydrolases classes des lyases classe des isomérases classe des ligases.

12 Nom systématique Le nom systématique fait référence à trois éléments : La nature du donneur La nature de l’accepteur Le type de réaction catalysée.

13 Nom commun recommandé C’est une appellation consacrée par l’usage, comme dans le cas des conceptions anciennes. Exemple : Phosphorylation du glucose a-D-glucose + ATP → a-D-glucose-6-P + ADP C’est une réaction de transfert d’un acide phosphorique de l’ATP sur le carbone 6 de l’a-D-Gl Numéro d’ordre = Nom systématique = ATP a-D-glucose Phosphate transférase Nom recommandé = Glucokinase.

14 III. Les grandes fonctions enzymatiques
III.1. Les réactions d’oxydo-réduction Transferts d’électrons accompagnés ou non d’un transfert de protons, depuis un corps donneur jusqu’à un corps accepteur. Exemple : CH3-CH2OH + NAD → CH3-CHO + NADH2 Ethanol Acétaldéhyde Les enzymes responsables sont les oxydo-réductases.

15 III.2. Les réactions de transfert
Voir phosphorylation du glucose. Les enzymes sont les transférases III.3. Les réactions d’hydrolyse Elles sont réversibles et sont catalysées par les hydrolases. Exemple : Hydrolyse acétylcholine par cholinestérase. Acétylcholine H3-CO-O-CH2-CH2-N+(CH3)3 -H2O H2O CH3-COOH + OH-CH2-CH2- N+(CH3)3 Acide acétique Choline Voir phosphorylation du glucose

16 III.4. Réactions catalysées par les lyases 
Addition ou retrait de groupements à des atomes de carbone impliqués dans des liaisons. Cela aboutit à la création ou à la saturation de doubles liaisons. Exemple :

17 III.5. Réaction d’isomérisation :
Réarrangements intramoléculaires réalisés par des isomérases. On distingue les sous catégories suivantes : Racémases (série L → série D) Mutases (transfert interne de radical d’un endroit à un autre d’une même molécule) Exemple : G-6-P → G-1-P (phospho-gluco-mutase) Epimérases (Exemple galactose → glucose) Cis trans-isomérases Exemple : Acide fumarique → Acide maléique.

18 III.6. Réactions de synthèse des ligases :
Ce sont des réactions de condensation entre 2 molécules différentes. Ce couplage nécessite une réaction de décomposition de l’ATP.

19 IV. Cinétique des réactions enzymatiques
IV.1. Le Complexe enzyme-substrat (ES) Complexe indispensable à la transformation du substrat en produit. Se forme grâce à la complémentarité d’une partie du substrat et d’une partie limitée de l’enzyme = site actif. IV.2. Vitesse réaction en fonction quantité enzyme On doit opérer en présence d’un excès de substrat. Dans ce cas la vitesse est proportionnelle à la quantité d’enzyme présente.

20 IV.3. Vitesse de la réaction en fonction de la concentration en substrat
Le modèle de Michaelis-Menten La transformation de Lineweaver-Burk.

21 Equation de Michaelis-Menten
V = Vmax [S] Km + [S] Km Vmax v [S] Vmax/2

22 Equation de Lineweaver-Burk

23 Transformation d’Eadie-Hofstee Transformation de Hanes

24 Cinétique Enzymatique
I. Influence des effecteurs physiques sur l’activité enzymatique I.1. Effet du pH sur l’activité enzymatique A un pH optimum l’activité enzymatique est maximale. Cette activité va décroître avant et après ce pH. Activité relative pH

25 I.2. Effet de la température sur l’activité enzymatique
A l’instar du pH, il existe pour chaque enzyme une température optimale d’action. L’augmentation de la température entraîne une chute de l’activité enzymatique par dénaturation de l’enzyme. Activité relative Tem (°C)

26 II. L’inhibition enzymatique
Certains composés agissent sur l’activité enzymatique en la favorisant (activateurs), ou en la défavorisant (inhibiteurs)  II.1. Effet des inhibiteurs   II.1.1. Inhibiteurs irréversibles  Agissent en bloquant définitivement ou en détruisant le site actif de l’enzyme   II.1.2. Inhibiteurs réversibles  Conservent plus ou moins intacts les sites actifs des enzymes.

27 Inhibition Réversible Compétitive (IRC)
 Dans ce modèle, l’inhibiteur entre en compétition avec le substrat pour la fixation sur le site actif de l’enzyme. Il y a donc une association exclusive de l’enzyme soit avec le substrat, soit avec l’inhibiteur.

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29 Exemple : Inhibition succinate déshydrogénase par le malonate.
Succinate = COOH-CH2-CH2-COOH Malonate = COOH-CH2-COOH La succinate DH est une enzyme du cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs) qui catalyse l’oxydation du succinate en fumarate. Le malonate, qui a une structure similaire à celle du succinate, va entrer en compétition avec le succinate au niveau du site actif de la succinate DH provoquant ainsi son inhibition.

30 Inhibition Réversible Non Compétitive (IRNC)
Dans l’IRNC, l’inhibiteur se fixe sur un site de l’enzyme différent du site de fixation du substrat ; il s’agit donc d’une fixation non exclusive. Mais cette fixation de l’inhibiteur entraîne une modification structurale de l’enzyme et de son site actif qui ne peut plus recevoir le substrat.

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32 Au plan expérimental, si l’effet de l’inhibition réversible est levé par l’addition de substrat, il s’agit d’une inhibition réversible compétitive. Sinon, c’est une inhibition réversible non compétitive. Inhibition incompétitive (variation simultanée de Km et Vmax) Inhibition par excès de substrat  

33 II.2. Effet des activateurs
Ils ont pour effet d’accélérer la vitesse des réactions enzymatiques. Ce sont en général de petites molécules telles que des cations métalliques qui s’associent à l’enzyme ou au complexe ES.

34 III. Structure-Mécanisme d’action-Régulation des enzymes
III.1. Site actif Aussi centre catalytique, représente partie relativement limitée de l’enzyme. Constitué de groupements fonctionnels qui ne sont pas voisins en structure primaire, mais qui se rapprochent du fait de l’évolution en structure secondaire et tertiaire.

35 Plusieurs méthodes permettent d’identifier le site actif, parmi lesquelles le marquage chimique. Les marqueurs chimiques vont se lier à des groupements complémentaires du site actif provoquant simultanément leur inactivation.

36 Le diisopropylfluorophosphate (DIFP), marqueur chimique pour la sérine
L’iodacétamide permet le marquage de la cystéine L’acétylation permet le marquage groupes NH2 L’estérification permet marquage COOH.

37 III.2. Relation entre structure spatiale et fonction catalytique des enzymes
En dehors des acides aminés du site actif qui ont un rôle de fixation, d’orientation et d’activation, il existe d’autres catégories d’acides aminés appartenant à la protéine enzymatique. Ce sont :  Les acides aminés collaborateurs : Ils ne participent pas directement à l’activité catalytique, mais leur disparition fragilise l’enzyme.

38 Les acides aminés auxiliaires : Ils assurent la mobilité de l’enzyme et participent à la fixation du substrat et à l’expulsion du produit. Les acides aminés non collaborateurs : Leur rôle n’est pas clairement défini et leur destruction est sans effet apparent sur l’activité catalytique.

39 III.3.1. Systèmes multienzymatiques
III.3. Régulation de l’activité enzymatique III.3.1. Systèmes multienzymatiques Les enzymes cellulaires ne travaillent pas de façon isolée. En général, le produit de l’action d’une enzyme devient le substrat d’une autre enzyme. E E E E4 A → B → C → D → Produit final  Les différentes transformations que subit le substrat A pour donner B, C, D et le produit final, constituent la chaîne séquentielle.

40 III.3.2. Enzymes de la glycolyse
Entités moléculaires distinctes mais agissent successivement les unes après les autres. III.3.3. Acide gras synthase Complexe multienzymatique difficilement dissociable. Enzymes prises isolément, deviennent inactives. III.3.4. Enzymes CRM Enzymes oxydatives liées toutes à la membrane interne mitochondriale.

41 III.4. Enzymes allostériques
III.4.1. Propriétés générales des enzymes allostériques  Plus volumineuses et plus fragiles que les enzymes michaéliennes Constituées d’un petit nombre pair de sous-unités (oligomères) Enzymes inactives à O°C et retrouvent leur fonctionnement optimal à +20°C.

42 Possèdent deux sites fonctionnels :
Un site actif Un site allostérique. La fixation de l’effecteur sur ce site entraîne une modification de la structure tridimensionnelle de l’enzyme encore appelée transition allostérique. Cette transition va se répercuter sur le site catalytique provoquant des modifications de l’activité de l’enzyme.

43 III.4.2. Cinétique des enzymes allostériques
Contrairement à la cinétique michaélienne (hyperbolique), la cinétique allostérique présente une allure sigmoïdale.

44 III.4.3. Phénomène de désensibilisation
Ce phénomène survient après action physique, chimique ou mutation génétique. Il se traduit par une perte de l’effet coopératif et une insensibilité aux modulateurs. Il y aura cependant conservation de l’activité catalytique et la courbe devient michaélienne.

45 IV. Les coenzymes A l’instar des autres protéines, on distingue les holoenzymes uniquement constituées d’acides aminés et les hétéroenzymes constituées d’une partie protéine dénommée apoenzyme et d’une partie on protéique. La partie non protéique est appelée cofacteur s’il s’agit d’un ion métallique ; on parlera de coenzyme si la partie non protéique est une molécule organique.

46 L’enzyme peut être liée à la coenzyme par covalence, dans ce cas la coenzyme porte le nom de groupement prosthétique, sinon il prend le nom de cosubstrat.

47 Les coenzymes participent aux réactions catalysées par les enzymes et sont régénérées à la fin de la réaction. Elles ne sont pas spécifiques et peuvent intervenir dans plusieurs réactions. Elles sont le plus souvent de nature vitaminique et sont apportées par les aliments. Elles comportent le plus souvent un noyau cyclique ou hétérocyclique.

48 Les coenzyme comme les pyridines nucléotides ou les flavines interviennent dans les réactions d’oxydo-réduction (exemple : NAD+, NADP+, FAD, FMN…) D’autres comme le phosphate de pyridoxal (PAL), le pyrophosphate de thiamine (TPP) ou la coenzyme A, sont associées à des enzymes de transfert de groupes.

49 V. Les isoenzymes Encore appelées isozymes. Formes moléculaires multiples d’une même enzyme. Actives sur le même substrat principal mais peuvent s’identifier grâce à leurs caractéristiques physicochimiques : Différence de charge Différence de pH optimum d’action Différence de thermostabilité Différence d’action sur substrats secondaires Différence d’inhibiteurs chimiques (urée, EDTA…).

50 L’une des propriétés les plus intéressantes des coenzymes est leur possibilité de s’hybrider, grâce à leur nature oligomérique avec deux ou quatre sous-unités.  Exemple : La lacticodéshydrogénase (LDH)  Cette enzyme favorise la transformation réversible du pyruvate en lactate. Elle est formée de 4 sous-unités de même poids moléculaire. Ces sous-unités sont de 2 types : le type M,  prédominant dans le muscle le type H, prédominant dans le cœur.

51 L’hybridation de ces sous-unités conduit donc à … Isoenzymes qui sont : ……………………… 
Ces isoenzymes comportent .. tétramères purs ………… et …… hybrides ………… Le type M et le type H ayant des charges électriques différentes, ces isoenzymes peuvent être facilement séparées par …………… à pH neutre ou alcalin. Le type H possédant plus de charges négatives se déplacera rapidement vers ………, tandisque l’iso M4 restera au point de dépôt.

52 Intérêt en pathologie : C’est surtout en cardiologie que l’étude des variations des isoenzymes de la LDH a trouvé son principal point d’application. En effet l’augmentation des LDH totales signe une souffrance cellulaire mais ne permet pas d’incriminer un organe donné. L’augmentation des isoenzymes LDH1 et LDH2 permet de confirmer une nécrose dune partie du muscle cardiaque (infarctus du myocarde).

53 Les isoenzymes de la créatine kinase (CK) sont également très utile dans le diagnostic de l’IM. Cette enzyme est constituée de 2 protomères ; le type M prédominant dans le muscle et le type B dans le cerveau. Ce dimère donne de … formes d’isoenzymes : la CK… ou CK1 dans le cerveau la CK-…. ou CK2 qui est une forme hybride la CK-…. ou CK3 dans le muscle Ces différentes formes sont séparables par électrophorèse sur gel d’agarose.

54 Dans l’infarctus du myocarde, l’activité globale de la CK est augmentée dans 95 % des cas et celle de la CK2 dans 100 % des cas. On distingue une autre forme isozymique, la CKm à localisation mitochondriale et dont les protomères sont différents des types M et B.

55 Les macroenzymes sont de nature très diverse et peuvent résulter :
VI. Les macroenzymes Les macroenzymes sont de nature très diverse et peuvent résulter :  association d’enzymes et d’IG formes enzymatiques autoagrégées Association enzymes avec lipoprotéines de fragments de membranes circulantes possédant des activités multienzymatiques

56 Ces formes inhabituelles d’enzymes doivent être reconnues car pouvant être sources d’erreurs diagnostiques. Les plus couramment décrites sont les macroamylases et les macrocréatines kinases.

57 V.1. Les macroamylases Deux types de macroamylases peuvent être distingués : association d’une molécule d’amylase avec une immunoglobuline (IgA ou IgG) plus rarement association avec des glycoprotéines ou des polysaccharides Leur masse moléculaire élevée pourrait simuler une affection pancréatique.

58 V.2.1. Les macro CK type 1 V.2. Les macrocréatine kinases
V.2.1. Les macro CK type 1  Résultent des associations suivantes : CK1 + IgG CK1 + IgA CK1 + IgM Ces macro CK de type 1, apparemment sans valeur pathologique, peuvent simuler une augmentation de la CK2 en l’absence de nécrose myocardique (faux positif).

59   V.2.2. Les macro CK type 2 Ce sont des complexes oligomériques de CKm dont la présence semble être de mauvais pronostic et s’observe dans les infarctus massifs.