CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: Cinétique

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1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: Cinétique
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

2 Réactions enzymatiques
Préparons une réaction enzymatique: Enzyme (chacun = 1 µmol) Ce sont les seules concentrations que l’on connait pcq nous préparons l’expérience. Substrat (chacun = 1 µmol) X min Produit CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

3 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline  Absorbe à 405 nm H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH O CH2 COO- CH CH3 H3C NO2 H2N pNA (jaune) H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH- DEVD-pNA (incolore) DEVD Caspase 3 (protéasehydrolase) Mesure l’augmentation de A405nm CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

4 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
2. Accumulation/utilisation d’un cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm (e = 6.3 molL-1cm-1 ) NAD+ = n’absorbe pas à 340 nm Mesure l’augmentation de A340nm Mesure la diminution de A340nm Lactate dehydrogenase CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

5 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être facilement détecté; Glutaminase + NH4+ 1ière réaction Mesure l’augmentation de A340nm Glutamate Dehydrogenase + NAD+ + NADH +H+ 2ième réaction + H2O Peut être détecté par HPLC (peu pratique) CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

6 Réactions enzymatiques
1 min 3 µmol / min Vitesse de la réaction 15 µmol S vs 1 µmol E Temps [Produit] Pente = vitesse initiale = v0 = [P] / time 2 min 3 µmol / min 4 min <3 µmol / min CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

7 Réactions enzymatiques
1 min 3 µmol / min 15 µmol S vs 1 µmol E 6 µmol / min 15 µmol S vs 2 µmol E 9 µmol / min 15 µmol S vs 3 µmol E Temps [Produit] v0 est proportionnel à [E] 1µmol E 2µmol E 3µmol E CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

8 Réactions enzymatiques
1 µmol / min 1 min [Substrat] v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax 2 µmol / min 1 min 3 µmol / min 1 min E saturé par S CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

9 Réactions enzymatiques
Donc: 1) v0 (la vitesse initiale) est la vitesse réactionnelle très tôt après l’initiation de la réaction  quand [P] est négligeable; 2) v0 peut être obtenue en prenant la pente du graphique de [P] vs temps (unités: concentration / temps) 3) v0 varie en fonction de [E]; 4) v0 augmente en fonction de [S] jusqu’à ce que E soit saturé par S. 5) Lorsque E est saturé par S  v0 = Vmax CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

10 Équation de Michaelis-Menten
La relation entre vo et [S] peut être vue comme une réaction à 2 étapes: Cette relation peut être exprimée par l’équation de Michaelis-Menten: [Substrat] v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E + S ES E + P k2 k1 k-1 RAPIDE LENT vo = Vmax [S] Km + [S] CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

11 Équation de Michaelis-Menten
Km est équivalent à la concentration de [S] requise afin d’obtenir la moitiée du Vmax; Km est une mesure de l’affinité de E pour S: Plus Km est bas, moins on aura besoin de S pour que E atteigne ½ Vmax, et plus l’affinité de E pour S sera élevée. [Substrat] v0 Vmax ½ Vmax Km1 Km2 E2 E1 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

12 Km CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

13 Turnover number A des concentrations de [S] saturantes:
vo = Vmax vo est déterminé par [E] k2 caractérisera la vitesse de la réaction; k2= kcat Donc: Vmax = kcat [E]totale kcat = Vmax/[E]totale kcat = turnover number = nombre maximum de molécules de substrat converties en produit par seconde par site actif de l’enzyme (units = s-1); 1/kcat = temps requis pour que E convertisse 1 molécule de substrat en produit (i.e. temps requis pour une réaction catalytique). Unités: s. E + S ES E + P k2 k1 K-1 RAPIDE LENT CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

14 Mesure de Km et Vmax Km ou Vmax ne peuvent pas être directement obtenus à partir de données de cinétique enzymatiques: Vmax est rarement atteint (c’est une courbe de type hyperbole…); [Substrate] v0 Vmax ½ Vmax Km CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

15 Mesure de Km et Vmax 1/vo 1 = Km x 1 + 1 vo Vmax [S] 1/Vmax 1/[S]
Cependant, on peut facilement obtenir Km et Vmax en prenant la réciproque (et en réarrangeant un peu) l’équation de Michaelis-Menten: on obtient alors l’équation de Lineweaver-Burk: Le graphique de 1/vo vs 1/[S] donne une droite dont: Intercepte sur l’axe des x = -1/Km Intercepte sur l’axe des y = 1/Vmax C’est la façon la plus facile pour déterminer avec précision Vmax et Km: Tu connais [S] (c’est toi qui a préparé l’expérience!!!) V0 est facilement obtenue expérimentalement (pente de [P] vs temps). 1/vo 1/[S] 1/Vmax -1/Km Graphe de Lineweaver-Burk 1 vo = Km x Vmax [S] CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.