Préparation des échantillons

Présentation au sujet: "Préparation des échantillons"— Transcription de la présentation:

1 Préparation des échantillons
ABC/BVC Mai 2002 – Montgodinne N.Schaaf-Lafontaine Laboratoire d’Hématologie CHU ULg

2 Cellules et Flux Le cytomètre de flux analyse la fluorescence et la lumière diffusée de cellules en suspension. Si les cellules sont en suspension dans l’échantillon (cultures, sang…), la préparation et l’analyse sont directes tandis que dans le cas de tissus solides, il faut une étape supplémentaire de dissociation . Le volume de suspension cellulaire requis est habituellement 0.5 ml et la concentration idéale 105 à 106 cellules /ml. La suspension cellulaire ne doit pas contenir de débris cellulaires ni d’aggrégats afin de réduire les risques d’obstruction des tubulures. Lorsque l’expression de la molécule recherchée est à la fois intracellulaire et membranaire, il faut s’assurer de la localisation détectée.

3 Fluorochromes Les anticorps monoclonaux et polyclonaux (préparations purifiées ou fractions Fab’2 de préférence) sont couplés à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) le plus souvent. Pour la réalisation de marquages multiples, on utilise simultanément des anticorps monoclonaux couplés chacun à un fluorochrome différent. Avec un laser argon 488 nm, les combinaisons les plus courantes sont : FITC/PE FITC/IP FITC/PE/PerCP FITC/RD1/ECD/PC5….. Avec 2 lasers (Argon 488nm et HeNe 633 nm) FITC/PE/APC FITC/PE/ECD/APC

4 Méthode directe / Méthode indirecte
Il est possible de conjuguer (covalence) des protéines et d’autres molécules à des colorants fluorescents tout en préservant leur activité biologique. De tels conjugués peuvent ensuite être utilisés pour la détection des molécules auxquelles ils se lient. Certaines de ces molécules fluorescentes ont la propriété de se lier directement à des éléments cellulaires (par ex. Ac.nucl.). Il est possible de coupler ces fluorochromes à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sans perte de spécificité lors de la liaison à l’antigène.

5 Titration des réactifs anticorps
Il est recommandé de titrer les préparations d’anticorps utilisés (commerciales ou non) sur les populations cellulaires d’intérêt. Cette titration est réalisée par dilutions successives du réactif pour un nombre standard de cellules ( 106 dans 100 µl pour chaque dilution). Le même volume de réactif étant utilisé pour chaque point. Pour une manipulation comprenant lavage suivi de fixation, la dilution précédant l’intensité maximale est choisie.

6 Immunomarquage (1) Les Anticorps sont généralement conservés en solution en présence d’azide Les anticorps non couplés sont très stables et leur réactivité peut se maintenir pendant des années à condition de ne pas subir de fréquents cycles de congélation-décongélation. Les Anticorps couplés à un fluorochrome sont beaucoup moins stables et seront conservés à 4°C, dans l’obscurité et en présence d’azide. Les Anticorps monoclonaux qui reconnaissent un même antigène, à moins d’appartenir à un même clone, peuvent différer en spécificité d’épitope, avidité, isotype et réaction croisée. Le marquage aspécifique de bruit de fond et les réactions croisées sont plus faibles après marquage par Anticorps monoclonaux (versus polyclonaux). Toutes les réactions Anticorps-Antigène sont réversibles. Les cellules colorées seront maintenues à 4°C. L’analyse de fluorescence après immunomarquage se fait d’autant plus rapidement que les cellules ne sont pas fixées.

7 Immunomarquage (2) • Les anticorps vont se lier aux cellules non seulement par une réaction spécifique paratope-épitope mais aussi, avec une affinité plus faible cependant, par une réaction aspécifique à d’autres éléments cellulaires. • Les récepteurs pour le fragment Fc des Igs exprimés à la surface de certaines cellules sont en partie responsables de ce type de liaison. Le choix des réactifs d’immunomarquage, la classe ou sous-classe des anticorps, sera adapté aux propriétés des cellules étudiées. Les réactifs IgM génèrent fréquemment ce type de réaction aspécifique. • Cette liaison est d’autant plus importante que le réactif contient des aggrégats d’Igs. Ceux-ci seront en partie éliminés par une courte ultracentrifugation. • La liaison aspécifique sera réduite si les cellules lavées ou isolées sont prétraitées par des Igs normales non couplées ou par du sérum de même origine (espèce) que les anticorps « réactifs ». -10 µg d’Igs contrôles purifiées de même origine pour 106 cellules 10 min. à 4°C - 2-5% de sérum inactivé avant l’addition du réactif d’immunomarquage - utilisation de BSA (0.5 à 10%) ou de SVF dans le milieu de lavage et d’incubation des cellules.

8 FIXATEUR PARAFORMALDEHYDE
Forme polymérisée de Formaldéhyde, solide à T° ambiante mais se dissout lentement en solution aqueuse en chauffant à 60°C pendant 1heure ou plus Sous hotte (Toxicité) Une polymérisation survient progressivement en solution aqueuse ; il faut préparer régulièrement (7 jours) une solution fraîche Formaldéhyde ne convient pas à l’exception du réactif « microscopie électronique » Les solutions de fixation pour cytométrie proposées par les firmes conviennent La fixation : - modifie le plus souvent l’antigénécité des protéines de surface des protéines cytoplasmiques - ne modifie pas la portion carbohydrates des gps - de préférence à T° ambiante et en absence de protéines extracell.(sérum par ex.) - augmente l’autofluorescence des cellules La fixation perméabilise les cellules: concentration faible: de petites molécules pénètrent concentration forte: des molécules d’anticorps peuvent pénétrer Après immunomarquage des cellules, la conservation de fluorescence est possible L’excès de protéines est éliminé par lavages et le stockage a lieu dans une solution 1% de paraformaldéhyde en PBS

9 Prélèvement de Sang périphérique
Cet échantillon est hétérogène du point de vue de la cellularité et sera manipulé différemment selon la population d’intérêt. Les cytomètres ont la propriété de distinguer ces populations en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de la lumière. Le sang est prélevé dans un tube contenant un anti-coagulant. Les caractéristiques morphologiques et de diffusion de lumière des cellules seront mieux préservées en présence d’Héparine. L’EDTA réduit le Ca2+ libre et peut altérer l’analyse des fonctions dépendantes de Ca2+. Le prélèvement est immédiatement homogénéisé avec l’anicoagulant par retournements lents. Les tubes en polypropylène, comparés au verre et au polystyrène, ont la propriété d’offrir des conditions minimales d’adhérence et d’activation des plaquettes et des éléments myéloides. Les échantillons ne doivent pas être refroidis mais maintenus à 20°C environ. L’immunomarquage sera réalisé le plus rapidement possible sur un échantillon ne contenant pas de traces de coagulation. Les plaquettes activées peuvent former des aggrégats importants qui interfèrent avec l’analyse des leucocytes.

10 Immunophénotypage des Leucocytes du sang
Les érythrocytes non-nucléés constituent la population majeure dans le sang et leur grand nombre va réduire la vitesse d’analyse des leucocytes. Pour cette raison, les leucocytes peuvent être isolés: - par centrifugation sur gradient de densité. - par lyse des érythrocytes • Les érythrocytes nucléés présents dans le sang des jeunes enfants et dans les prélèvements de moelle osseuse sont résistants à la lyse et ont des propriétés FSC/SSC proches de celles des lymphocytes. Il est possible de distinguer ces 2 populations en utilisant un marquage: - anti-CD45 (Gp présente sur les leucocytes et non sur les plaquettes et les érythrocytes) - anti-Glycophorin A (erythr+/lympho-)

11 Prélèvement de moelle osseuse
Le prélèvement se fait en présence d’anticoagulant et les échantillons sont conservés à 20°C et traités le plus rapidement possible. La cellularité est hétérogène. Des érythrocytes nucléés ou non sont présents et seront éliminés (cfr sang) si le but de l’analyse est l’immunophénotypage des leucocytes. Le prélèvement peut contenir une certaine quantité de sang; il ne sera pas possible d’identifier les origines respectives des cellules analysées Il est utile de se référer aux prélèvements prévus pour l’analyse cytologique. Les analyses les plus fréquentes sont: -immunophénotypage des leucocytes - évaluation des cellules CD34+ - index ADN

12 Lyse des Erythrocytes L’application, aux prélèvements de sang et de moelle osseuse, des techniques de lyse des hématies permet l’analyse des leucocytes des échantillons non séparés sur gradient de densité. Différentes méthodes sont proposées dans la littérature : H2O, solution de NH4Cl, Saponine. De nombreuses solutions commerciales sont proposées. La prudence s’impose dans le choix de la méthode et la technique sera soigneusement validée pour chaque application. Certaines cellules nucléées ne conservent pas toutes leurs propriétés au cours de ces manipulations. Les solutions commerciales contiennent parfois des éléments fixateurs; dans ce cas, l’incubation des cellules avec les réactifs d’immunophénotypage doit s’effectuer avant l’étape de lyse. Dans tous les cas, ces solutions seront conservées soigneusement et très régulièrement préparées (quelques jours !!!) et utilisées à T° ambiante.

13 Suspensions cellulaires réalisées à partir de tissus solides ou de cultures
Par traitements enzymatiques: Trypsine Collagénase Dispase Par moyens mécaniques : ciseaux petit scalpel potter en verre tamis métallique. Des agents chélatants (EDTA ou Citrate) sont utilisés avec la Trypsine par ex; ce qui empêche Ca2+ et Mg2+ de maintenir la stabilité de la matrice. Seuls, ces agents ne peuvent libérer les cellules. L’activité collagénase requiert la présence de Ca2+, il ne faut donc pas introduire ces agents lors de ces manipulations. L’emploi de Dnase permet de limiter la formation d’aggrégats cellulaires autour de l’ADN libéré par les cellules endommagées. La digestion enzymatique fournit généralement une suspension cellulaire de viablilté supérieure à celle obtenue par dissociation mécanique. Certaines molécules de la surface cellulaire pourraient subir un clivage lors de l’incubation en présence d’enzymes. Il faut contrôler la résistance de l’épitope spécifique des anticorps monoclonaux utilisés en immunomarquage.

14 Tests Fonctionnels Les cellules analysées en cytométrie de flux après immunomarquage peuvent être triées sur base de l’expression de certaines molécules et ensuite utlisées dans des tests fonctionnels (migration, cycle cellulaire, expansion clonale,…). Dans ce type d’application, la viabilité des cellules est essentielle; elle sera évaluée dès le départ des manipulations : Bleu Trypan (colorant vital) Iodure de Propidium (se lie à l’ADN des cell.mortes) Les cellules endommagées ou mortes, susceptibles d’entraîner la formation d’aggrégats, seront retirées de la suspension cellulaire par : filtration sur filtre de nylon par ex ou centrifugation en gradient de densité. La survie sera assurée par une incubation en milieu nutritif (Milieu de Culture RPMI 1640 ou solution saline de Hank’s) dépourvu d’indicateur coloré tel que Rouge phénol. Le pH du milieu doit être maintenu stable (utilisation de Hepes possible). Des protéines, saturation des sites de liaison non-spécifiques, seront ajoutées dans le milieu d’incubation. BSA ou sérum, ce dernier sera décomplémenté car il pourrait activer le clivage de certaines molécules de la surface cellulaire. La T° sera maintenue à 4°C après immunomarquage car la présence d’anticorps liés à certaines structures de la membrane plasmatique peut induire du « capping » voire de l’internalisation des structures recherchées.

15 Perméabilisation Etape nécessaire pour la détection d’antigènes intracellulaires ( enzymes, cytokines*…) par immunomarquage. Les anticorps couplés sont des macromolécules de taille importante, leur entrée dans la cellule requiert une perméabilisation préalable ou simultanée à l’étape d’immunomarquage. En même temps: éviter la diffusion de l’antigène recherché conserver les caractéristiques FSC/SSC des cellules Ces conditions sont rencontrées en fixant les cellules (paraformaldéhyde) de façon à stabiliser les membranes et ensuite en incubant en présence des anticorps**, de Saponin (perméabilisant) et d’un agent bloquant (SVF ou BSA pour réduire la liaison non-spécifique). Effectuer les lavages en présence de Saponin. D’autres combinaisons sont possibles, par ex. Méthanol/Acétone , Ethanol 70% et réactifs commerciaux. Chaque antigène recherché nécessite une mise au point précise qui respectera les caractéristiques FSC/SSC et évitera les liaisons aspécifiques Des contrôles seront réalisés en parallèle. *en présence de brefeldine les cytokines produites sont piégées dans la cellule. **méthode directe ou indirecte de marquage

16 Recommandations Les fluorochromes sont sensibles à la lumière et au pH. Les réactifs Anticorps se périment. Les solutions de lyse et de fixation s’altèrent rapidement La qualité de l’immunomarquage et de l’analyse en cytométrie dépend de la qualité de l’échantillon cellulaire. Un contrôle des résultats est possible au microscope à fluorescence après le passage au cytomètre. Une manipulation mal entamée ne peut se corriger. Certains réactifs sont toxiques (Azide, PAF, IP…) Il faut se protéger de la formation d’aérosols. Les prélèvements de sang humain (moelle, tissus lymphoides,..) sont susceptibles d’être contagieux.

17 Ouvrages de Références
Cytometric Analysis of Cell Phenotype and Function. Eds D.A. McCarthy and M.G.Macey. Cambridge University Press Immunophenotyping. Eds C.C.Stewart and J.K.A.Nicholson.Wiley-Liss.2000. Immunophénotypage des Leucocytes. Clusters de différenciation humains. Application à la caractérisation des Hémopathies; O.Lees, M.C.Béné et les membres du GEIL. Biothem Editions Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice. M.A.Owens and M.R.Loken.Eds Wiley-Liss