L’épilepsie et l’acide kaïnique.

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1 L’épilepsie et l’acide kaïnique.
Marcel Pagnol Cyril Llubet Julien Santangelo Sabrina Delcroix Jérémy Coquet Téténa Boinariziki Laureline Estival

2 Nous avons voulu comprendre comment cet acide
Des chercheurs se sont rendu compte que certains enfants avaient été soignés par des médicaments contenant de l’acide kaïnique. Cet acide est présent dans des algues marines par exemple. Beaucoup de ces enfants ont développé, plusieurs années après, des crises d’épilepsie. Nous avons voulu comprendre comment cet acide kaïnique (aussi appelé kaïnate) agit sur le cerveau. Pour cela nous avons réalisé plusieurs expériences : Expérience 1 : le kaïnate tue-t-il les cellules par nécrose ? Expérience 2 : Les empêche-t-il de proliférer ? Expérience 3 : Les cellules vivent-elle encore? (activité enzymatique) Expérience 4 : Etude de l’ADN.

3 Le kaïnate tue-t-il les cellules par nécrose ?
Expérience 1 Le kaïnate tue-t-il les cellules par nécrose ? Il existe deux morts cellulaires différentes : par nécrose et apoptose. La première est une mort «accidentelle» de la cellule; la membrane est déchirée et le contenu cytoplasmique se déverse dans le milieu extérieur. L’apoptose est une mort «programmée»; la cellule meurt de l’intérieur petit à petit en se décomposant, n’affectant pas ce qui l’entoure. Protocole : Dans des puits différents on ajoute aux cellules :  le témoin de vie : cellules dans leur milieu de culture  cellules dans l’eau pour un témoin de mort par nécrose  cellules + kaïnate à 40 µm  cellules + kaïnate à 400 µm  cellules + kaïnate à 4000 µm - Ajouter du bleu tripant (colorant) avant d’observer - Observer et photographier les résultats toutes les 15 min.

4 2) Observations au bout de 5min

5 Observations au bout d’ 1 heure

6 3) Conclusion On s’aperçoit que dans le puit contenant de l’eau, les cellules sont complètement éclatées, détruites. C’est une mort par nécrose. En revanche, on voit que dans les trois milieux contenant le kaïnate, il n’y a pas de différences apparentes avec le puit témoin contenant seulement le milieu de culture. On peut donc en déduire que l’acide kaïnique ne provoque pas une mort par nécrose. Mais il reste encore beaucoup de possibilités que cette expérience ne montre pas.

7 Les empêche-t-il de proliférer ?
Expérience 2 Les empêche-t-il de proliférer ? On veut maintenant savoir si l’acide agit tout de même sur les cellules : les empêche de proliférer par exemple ? 1) Protocole : - Préparer 4 puits de cellules :  1 témoin avec le milieu de culture  1 contenant de l’eau pour le témoin de la mort par nécrose  1 contenant un milieu de culture sans nutriments pour les empêcher de proliférer  1 contenant de l’acide kaïnique - Laisser passer 12h et comparer le puit contenant l’acide kaïnique avec les autres.

8 2) Observations le lendemain
Cellules + eau Cellules + milieu sans nutriments Cellules + milieu de culture Cellules + kaïnate

9 3) Conclusion On en conclue que dans l’eau, les cellules sont complètement détruites ; celles qui sont placées dans un milieu sans nutriments ne se prolifèrent pas du tout ; et celles qui sont placées dans leur milieu de culture prolifèrent normalement. On remarque alors que les cellules placées avec du kaïnate prolifèrent normalement elles aussi. L’ acide kaïnique n’agit donc pas sur la prolifération des cellules.

10 Expérience 3 : Les cellules vivent-elle encore? (activité enzymatique)
On veut maintenant voir si les enzymes des cellules ont toujours une activité, ce qui prouvera la vie ou la mort des cellules. 1) Protocole : Reprendre les 4 milieux de l’expérience précédente et y rajouter du MTT ( un substrat jaune qui devient bleu lorsque les enzymes mitochondriales ont une activité ). Attendre 4 heures. Observer la formation de cristaux bleus. Enlever le surnageant et ajouter de l’isopropanol. Un spectrophotomètre mesure l’absorbance du milieu. Plus l’absorbance est élevée plus l’activité enzymatique est grande: 2) Observation: (voir graphique) -Les cellules contenues dans l’eau n’ont pas d’activité enzymatique tandis que celles qui sont dans leurs milieux de culture en ont une maximale. Celles à qui ils manquent des nutriments ne prolifèrent pas mais ont tout de même une activité enzymatique puisqu’elles ne sont pas encore mortes (apoptose). On remarque que les cellules en présence de kaïnate ont une activité enzymatique comprise entre celle des cellules dans le milieu de culture et celle dans le milieu sans nutriment. 1: Milieu de culture : Milieu sans nutriments 3: Eau : Kaïnate 3) Conclusion On en conclue que les cellules sans nutriments ont toujours une activité enzymatique comme les cellules traitées par le kaïnate. Pour vérifier que les cellules meurent par apoptose, nous allons extraire l’ADN de ces cellules.

11 1 2 3 4 3) Conclusion : 2) Observations :
1: Milieu de culture : Milieu sans nutriments 3: Kaïnate : Marqueur de poid moléculaire On observe que dans les cellules en milieu de culture, l’ADN reste en grande partie dans le puit, il n’est pas donc pas fragmenté. Or dans le puit 2, on voit nettement que l’ADN a migré plus facilement. Cela signifie que l’ADN est fragmenté ( en début d’apoptose). Le puit 3, lui, ressemble fortement au puit 1. 3) Conclusion : Cette expérience ne prouve pas que le kaïnate tue les cellules par apoptose.

12 Tel est le métier de chercheur! ( pas des trouveurs !)
Conclusion générale Nous avons appris que l’épilepsie était provoquée par l’acide kaïnique pour certains cas. Nous nous sommes alors demandé comment agit cette acide sur nos cellules nerveuses. Nous avons donc découvert que l’acide kaïnique ne tuait pas les cellules par nécrose, ne les empêchait pas de proliférer, ne stoppait pas leur activité enzymatique et enfin on n’a pas vue pas par apoptose. Pour répondre ainsi a notre question de départ, il est nécessaire de chercher encore, il serait même recommandé de refaire nos propres recherches avec des concentrations différents etc… Tel est le métier de chercheur! ( pas des trouveurs !)