Les méthodes de marquage

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1 Les méthodes de marquage
Immunoréaction directe Echantillon Antigène ETAPES Anticorps primaire Traceur 1 Avantages inconvénients immunoréaction la plus simple et la plus rapide (une seule étape), peu d'anticorps directement marqués sont disponibles commercialement : nécessité de marquer soi-même l'anticorps, idéale pour les marquages multiples, sensibilité réputée inférieure à celle des techniques « en plusieurs étapes » distance minimale entre traceur et antigène : c'est la technique de marquage la plus précise.

2 ETAPES Traceur 2 Anticorps secondaire Anticorps primaire 1 Antigène
Immunoréactions en plusieurs étapes: Immunoréaction indirecte Echantillon Antigène ETAPES Anticorps secondaire Traceur 2 Anticorps primaire 1 Avantages inconvénients simple,  Au moins 2 fois plus longue qu'une immunoréaction directe ; il y a en effet une étape de plus que dans une réaction directe (un anticorps secondaire) et des lavages supplémentaires. bon marché  en principe plus sensible qu'une immunoréaction directe : plusieurs anticorps secondaires peuvent en effet se fixer sur l'anticorps primaire (non représentés sur ce schéma).

3 Echantillon Antigène ETAPES Anticorps secondaire 2 1
Immunoréaction "sandwich" (bridge) Pontage par anticorps secondaire Echantillon Antigène ETAPES Anticorps secondaire 2 1 Anticorps primaire Anticorps tertiaire 3 Traceur 4 Immunoréaction "sandwich" (bridge) Pontage par anticorps secondaire (variante) Echantillon Antigène ETAPES Anticorps secondaire 2 Anticorps primaire 1 Anticorps tertiaire 3 Traceur

4 3 molécules de peroxydase (ou de phophatase alcaline)
Techniques « sandwich » avec pontage par protéine A ou G Echantillon Antigène ETAPES Protéine A ou G 2 Anticorps primaire 1 Anticorps secondaire 3 Traceur Techniques « sandwich » avec complexe Peroxydase-Anti-Peroxydase ou phophatase alcaline-anti- phophatase alcaline Echantillon Antigène ETAPES Anticorps primaire 1 3 Anticorps secondaire 2 PAP 3 molécules de peroxydase (ou de phophatase alcaline)

5 Titre : Affinité des protéines A ou G pour les immunoglobulines de différentes
espèces animales Titre : Affinité des protéines A ou G pour différentes classes d’immunoglobulines Protéine A : Protéine de daltons extraite de Staphylococcus aureus. Elle possède 4 sites de liaison pour le fragment Fc des immunoglobulines, mais est en pratique bivalente. Protéine G Protéine d'environ daltons extraite de la paroi cellulaire de Staphylococcus aureus. Elle se fixe, comme la protéine A, sur le fragment Fc des immunoglobulines. (Attention : elle possède un site d'interaction avec l'albumine). Très important : la protéine A et G ne réagissent pas avec toutes les IgG, voir tableaux.

6 ABC Complex Marquages par le système avidine-biotine : LAB Labelled
Avidin-Biotin BRAB Bridged ABC Complex IgG Biotine avidine marquée Traceur avidine Biotine marquée L’avidine : Glycoprotéine isolée du blanc d'œuf (masse moléculaire daltons). Elle est formée de 4 sous-unités identiques. Chaque unité présente un site de liaison pour un coenzyme, la biotine (vitamine H). L'affinité avidine-biotine est extrêmement élevée (Kd = 10-15). Sa partie glyosylée peut être à l'origine de marquages non spécifiques (Pour cette raison, on lui préfère souvent la streptavidine, molécule non glycosylée). La neutravidine : C’est la forme déglycosylée de l’avidine et l'absence de chaines latérales hydrocarbonées font que le bruit de fond est parfois moins élève qu'avec l'avidine (moins de liaisons non spécifiques) La streptavidine : Protéine de daltons extraite de Streptomyces avidinii. Sa structure est très semblable à celle de l’avidine : elle est formée comme celle-ci de 4 sous-unités. Chaque sous unité possède 1 site de très haute affinité pour la biotine (Kd ~10-15). Ll'absence de chaines latérales hydrocarbonées font que le bruit de fond est moins élevé qu'avec l'avidine).

7 Marqueur = LAB Marqueur = BRAB Marqueur = LAB Marqueur = BRAB ETAPES
Système biotine-avidine Anticorps primaire biotinylé ETAPES 2 Avidine marquée 1 Anticorps biotinylé Biotine 3 Marqueur = LAB Marqueur = BRAB Système biotine-avidine Anticorps secondaire biotinylé ETAPES Avidine 3 1° anticorps 1 2° anticorps biotinylé 2 Biotine marquée 4 Marqueur = LAB Marqueur = BRAB

8 Avantages inconvénients faible taille du complexe anticorps-biotine : technique conseillée pour les marquages en pré-inclusion ;  difficiles à optimiser (plusieurs étapes), effet amplificateur,  techniques longues, Forte sensibilité