ENZYMOLOGIE -Principe général

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1 ENZYMOLOGIE -Principe général
Spécificité de l'association [protéine - ligand] -Contrôle de l'activité enzymatique FLEXIBILITÉ CONFORMATIONNELLE DES PROTÉINES Interactions protéine-ligand Enzymes Allostériques Pr Miloud SLIMANI Département de Biologie Faculté des Sciences Université de Saida (Algérie) Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

2 Structure des Protéines :
-Les protéines jouent un rôle biologique ,le nombre et la séquence des acides amines sont définis par les gènes et apparaissent comme le résultat de la réplication, de la transcription et de la traduction du génome. -Les structures secondaires s’arrangent les unes par rapport aux autres pour former la structure tridimensionnelle de la protéine, c’est la structure tertiaire des protéines. La structure tertiaire est particulièrement importante pour l’activité des protéines. Elle permet à des acides aminés très éloignés au niveau de la chaîne primaire de se retrouver très proches spatialement. -Leurs multiples fonctions dépendent de leur repliement en une structure tridimensionnelle unique, de leur flexibilité et de leur mobilité. Le mauvais repliement des protéines est à l’origine de nombreuses pathologies neuro-dégéneratives comme la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, ou la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

3 Représentation de la structure des protéines : de la structure primaire à la structuture tridimentionnelle Pr M.SLIMANI

4 Le repliement des protéines -notion de site actif
Les protéines sont synthétisées par le ribosome à partir de l’ARN messager. Elles doivent alors se replier dans leur conformation biologiquement active. Le repliement des protéines est le processus physique par lequel les chaînes polypeptidiques acquièrent leurs structures tridimensionnelles . Cette conformation est appelée état natif de la protéine La protéine biologiquement active est dite à l’état natif : N. Lorsque la structure tridimensionnelle de la protéine est altérée, la protéine est dite à l’état dénaturé : D. Il existe un équilibre thermodynamique entre la multitude d’états dénaturés, D, et l’état natif N. Schéma de l’équilibre entre la protéine à l’état natif N et l’état dénaturé D Pr M.SLIMANI

5 La plupart des protéines repliées possèdent un cœur hydrophobe dans lequel l'ensemble des chaines latérales hydrophobes stabilisent l'état replié, et des chaînes latérales polaires ou chargées sur leur surface exposée au solvant par lesquelles elles interagissent avec les molécules d'eau environnantes La structure des protéines est le résultat d’un équilibre fragile entre des forces compensatoires puissantes Pr M.SLIMANI

6 -Ligand :Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une enzyme
Notion de site actif Les protéines  se replient dans une conformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquièrent leur activité biologique . Ce repliement aboutit à une structure tridimensionnelle fonctionnelle unique de la protéine. -Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière, le site actif  (souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter une structure spatiale qui est reconnue par le ligand spécifique de la protéine -Ligand :Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une enzyme - A ce site, le substrat est transformé en produit, puis celui-ci est libéré. . Site actif Pr M.SLIMANI

7 Le site actif est une zone constituée de quelques acides aminés localisés dans la zone interne hydrophobe de la protéine et au niveau de laquelle s’exerce la catalyse. Ce site actif est formé de deux sites : -1)-fixation du substrat ( site de fixation , de reconnaissance) est constitué de certains Acides aminés qui sont associés avec l’orientation du substrat , et avec la spécificité de l’enzyme ,responsable de la stéréospécificité. -La stéréochimie qui résulte de cet agencement unique des acides aminés qui constituent le site actif est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance  entre ces acides aminés et le (ou les) ligand(s). la structure (encombrement stérique) sont spécifiquement adaptés à la reconnaissance du (ou des) ligand(s). 2)-transformation du substrat ( site catalytique ) est constitué des résidus qui sont directement impliqués dans la formation et rupture des liens chimiques. Ces résidus sont souvent localisés dans le fond de la cavité, et dans la majorité des cas, possèdent des chaînes latérales ioniques ou réactives (ex. His, Lys, Cys, Ser, Asp, Glu). -Les autres AA sont qualifiés d'auxiliaires, de collaborateurs ou de non collaborateurs . Pr M.SLIMANI

8 NOTION DE SITE ACTIF Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme. Les orbitales des groupements catalytiques et du groupement réactionnel du substrat sont alignées de manière optimale pour l'acte catalytique Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

9 -liaisons non covalentes :
Nature des liaisons : Quatre grands types d’interaction gouvernent le repliement d’une protéine : Les liaisons hydrogène , les interactions hydrophobes , les liaisons électrostatiques et les forces de Van der Waals , sont toutes de nature non covalente ,elles ont une influence importante sur la conformation des protéines. A ces liaisons non covalentes, s’ajoutent les ponts disulfures (S-S) est une liaison covalente forte qui, par oxydation, réunit les fonctions thiol de deux cystéines dans une protéine (énergie de liaison de 160 kJ/mol). Ces liaisons covalentes sont impliquées dans la stabilisation de certaines protéines -liaisons non covalentes : Liaison hydrogène : s’établissent entre un atome d’hydrogène lié de façon covalente à un atome électronégatif ( oxygene, ou azote) et un autre atome électronégatif qui sert d’accepteur de la liaison d’hydrogène et participent largement à la stabilisation des structures protéiques. Elles sont faibles( 4 et 20 kJ/mol) mais ces défauts sont compensés par leur très grand nombre qui leur permet d'avoir un rôle essentiel dans le maintien de la structure secondo-tertiaire. . Pr M.SLIMANI

10 - liaisons ioniques (électrostatiques ) sont des liaisons faibles résultant de l'attraction entre deux groupes polaires de charges opposées, comme le groupement amine positif (Lys,Arg,His) et un groupement carboxylique négatif (Asp,Glu). L’origine de ces interactions est l’attraction ou la répulsion coulombienne, donnée par la loi de Coulomb. la force d’attraction est de 20KJ/mol La loi de Coulomb Cette loi permet de prévoir l’intensité (ou valeur) de la force d’interaction électrostatique( En Newton :N) Cette force électrique en Newton(N) dépend de trois facteurs : -La valeur des deux charges qA et qB( Coulomb) -La distance r qui sépare les deux charges, -k : Constante de la loi de Coulomb = N.m2 /C2 F = k. qAqB/r2 Asp-COO NH3-Lys Attraction : charges signes contraires ( qAqB  0 ) Répulsion : Charges signes semblables ( qAqB  0 ) Pr M.SLIMANI

11 Interactions hydrophobes :
La séquence d'une protéine  comporte une certaine proportion d'acides aminés polaires (hydrophiles) et non polaires (hydrophobes). Les interactions hydrophobes (énergie de liaison d’environ kJ/mol) , elles s'effectuent entre deux molécules non polaires, en présence d'eau, celles-ci auront tendance à s'associer pour exclure l'eau. La zone hydrophobe (les groupements apolaires) est enfouie à l'intérieur de la molécule, excluant l'eau(protéines globulaires solubles) formant un cœur hydrophobe. Ce phénomène stabilise les structures tertiaires. L’effet hydrophobe est le facteur le plus important pour la stabilité d’une structure protéique et impliqués dans le processus de repliement. Interactions de van der Waals Incluent des forces d’attraction et de répulsion existant entre les atomes et à courte distance. Les forces d’attraction proviennent des dipôles instantanés induits par des fluctuations de la distribution de la charge électronique dans des atomes voisins non liés ; ce qui conduit à des interactions de type dipôle-dipôle induit. Il s’agit d’interactions entres dipôles ,extrêmement faibles (100 fois plus faibles qu’une liaison covalente) mais très nombreuses. Collectivement, elles représentent un facteur non négligeable de la stabilisation des protéines. - Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

12 Types de liaisons non covalentes stabilisant la conformation des protéines
Pr M.SLIMANI

13 Flexibilité et dynamique structurale des protéines
Les structures de protéines sont très dynamiques et leurs fonctions biologiques sont intimement liées à cette dynamique qui leurs permettent de s’ajuster avec une autre molécule. 1-La flexibilité conformationnelle des protéines: Les structures des protéines doivent être suffisamment flexible pour que l’énergie libre nette libéré par la fixation et ou la transformation chimique du ligand permette les changements nécessaires des protéines et d’adopter des conformations pour répondre à la présence d’autres molécules (déplacement de chaînes latérales des acides aminés). .-Les protéines se déforment pour s’adapter à leur partenaire, pour former des interactions spécifique et pour améliorer la complémentarité de surface autorisant la formation de liaisons hydrogène pour changer leur conformation au cours de réactions enzymatiques ( enzymes allostériques) , de fixer des ligands d’une manière optimale, pour la catalyse par exemple ou à celles dont l’énergie est couplée à un travail mécanique (les pompes). -L’adaptabilité ou la flexibilité d’une protéine peut résulter, soit la transition d’un état à un autre sont nécessaires pour réguler l’activité, par exemple: le passage d’un état inactif à un état actif ou d’un état de faible affinité à un état de forte affinité ,soit de changements comme le déplacement de la chaîne latérale de quelques acides aminés pour lier un substrat. Pr M.SLIMANI

14 2- Phosphorylation –déphosphorylation:
Exemples de changements de conformation induits par la fixation d’un ligand 1- La liaison avec l'ion calcium induit un changement de conformation de la protéine et forme un complexe calcium-calmoduline (Ca2+-CaM) (une molécule de calmoduline pour quatre ions calciques) . Ce complexe permet l'activation, par changement de conformation, de nombreuses protéines, dont l'adénylate cyclase. 2- Phosphorylation –déphosphorylation: La fixation de groupements de phosphate sur une protéine modifie légèrement sa structure , et don son activité biologique ( exemple :les protéines kinases transfèrent le phoshate de l’ATP cytosolique sur un certain nombre de protéines (réaction de phosphorylation Pr M.SLIMANI

15 3-Changement de conformation induits par la fixation d’un radical phosphate sur un résidu de sérine d’une protéine 4-Le passage d'une conformation à une autre est régulé par la fixation d'un ligand spécifique : canal ionique [ouvert/fermé] Pr M.SLIMANI

16 R: active T : inactive 5- Enzyme allostérique:
chaque sous unité catalytique peut exister sous deux états conformationnels : -une forme T tendu (tense) à faible faible affinité pour le substrat -une forme R : relâché ( relased ) à forte affinité pour le substrat . Lorsque l’énergie interne d’un protomère augmente par suite de la modification de ces liaisons, on dit qu’il passe à un état tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposent une structure correspondant à une énergie interne diminuée, on dit qu’il passe à un état relâché c'est la fixation du ligand qui modifie l'équilibre entre les formes R et T. -En présence du substrat , l’équilibre est déplacé vers R  -En l’absence du substrat , l’équilibre est en faveur de T -Un effecteur inhibiteur favorisera le maintien de la forme T de l'enzyme - Inhibiteur Substrat ou activateur R: active T : inactive Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

17 R-HPS90 R-H R –H-HRE(ADN) ARNm
6-Récepteurs nucléaires En l’absence d’hormone, les récepteurs aux hormones stéroides existent sous forme d’un complexe inactif composé de plusieurs protéines dont les protéines chaperonnes, telles que les protéines de choc thermique ("heat shock protein" ou Hsp) Hsp 90, Hsp 70, la protéine p23 ou la protéine p60. Le rôle de Hsp90 et des autres protéines chaperonnes serait de maintenir le récepteur dans une conformation adéquate lui permettant de répondre rapidement à un signal hormonal. La liaison de l’hormone au récepteur entraine la dissociation de ce complexe et permet l’activation du récepteur et sa liaison à l’ADN. R-HPS R-H R –H-HRE(ADN) ARNm Traduction protéines H lipophile Cytoplasme Noyau Récepteur libre inactivé( R-HSP90) Récepteur-Hormone Activé (R-H) HRE : Hormone Responsive Element HSP90 Pr M.SLIMANI

18 Deux modèles pour expliquer la spécificité des enzymes:
La complémentarité stérique entre l’enzyme et son substrat est a l’origine de cette spécificité et que les enzymes et les substrats se reconnaissent comme une clé s’adapte dans une serrure(Fisher , 1890) la protéine et le ligand sont rigides. site actif = serrure principe actif = clé site actif + principe actif = clé dans la serrure « lock-and-key » Forme induite: modèle d’ajustement induit (Koshland , 1958 ) , l’enzyme change sa conformation lors de la liaison du substrat (induced-fit) Ajustement induit dynamique -lors de la fixation de substrat, l’enzyme change de conformation Suppose que l’enzyme a une structure flexible Le changement de conformation est influencé par des contraintes électroniques , l’énergie de désolvatation ou des interactions de Van der waals. La protéine s’ajuste au ligand , optimisant les interactions entre eux. Cet ajustement des protéines et de leurs ligands est essentiel aux activités biochimiques des protéines. Pr M.SLIMANI

19 - La dénaturation : : Perte d’activité biologique d'une protéine due à une altération de sa conformation native oud'une désorganisation de sa conformation tridimensionnelle, par rupture des liaisons faibles essentiellement. Elle se traduit souvent par une perte de solubilité (précipitation).Elle est provoquée par divers agents dénaturants, tels que des détergents , des solvants organiques , les radiations , la chaleur et des molécules comme l’urée et le chlorure de guanidine .Tous ces agents interférant avec les différentes intéractions qui stabilisent la structure tertiaire de la protéine. Les liaisons disulfure d’une protéine sont typiquement rompues par l’addition d’un agent réducteur tel que le mercaptoéthanol , qui transforme les ponts disulfure en une paire de groupements sulfhydryle (-SH) . Les acides forts ou les bases fortes dissocient les liaisons électrostatiques de la structure tertiaire entraînant la dénaturation de la protéine. Les agents oxydants ou réducteurs forts peuvent aussi dénaturer les protéines en oxydant des cystéines ou en réduisant les ponts disulfures. Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

20 Méthodes d’études : La dynamique des protéines et leurs propriétés mécaniques peuvent être étudiées expérimentalement. l’utilisation de plusieurs techniques est nécessaire pour recueillir des informations sur les propriétés dynamiques des protéines. -Les méthodes spectroscopiques : Les propriétés spectrales des protéines dépendent de leur composition en acides aminés mais aussi de l’environnement de ces acides aminés. -la fluorescence (technique basée sur l’absorption électronique, quand on réalise une transition électronique, le retour à l’état fondamental de l’électron peut s’accompagner de l’émission d’un photon : c’est le phénomène de fluorescence) .Les protéines absorbent et émettent des radiations dans la zone UV. L’absorbance résulte des propriétés des liaisons peptidiques, des acides aminés aromatiques et des ponts disulfure. Dans ce cas l’énergie lumineuse induit un passage des électrons d’un état stable à un état excité., ou le dichroïsme circulaire (apparaît dans toute molécule optiquement active , c’est le cas des molécules biologiques du fait de leur chiralité : la lumière polarisée à droite ou à gauche n’est pas absorbée avec la même intensité ). Pr M.SLIMANI

21 -Dichroïsme circulaire:
Toute onde lumineuse possède deux composantes circulaires de polarisation : gauche et droite. Le dichroïsme circulaire est la mesure de la différence d’absorbance pour des ondes polarisées circulaires droite et gauche (dans la gamme de nm). C’est une caractéristique des molécules chirales. La spectroscopie du dichroïsme circulaire est surtout utilisée afin de mesurer la teneur globale en éléments structuraux secondaires des peptides et des protéines (en sondant dans l’UV lointain, de nm) et la chiralité liée à des arrangements spécifiques des chaînes aromatiques ainsi que des ponts disulfures dans une protéine (en sondant dans l’UV proche, de 250 à 300 nm). La plupart des molécules biologiques, y compris les protéines, possèdent des chromophores chiraux et les spectres du dichroïsme circulaire correspondants contiennent des informations sur l’arrangement tridimensionnel. Pr M.SLIMANI

22 - La spectroscopie RMN offre des possibilités uniques d’étude dynamique des macromolécules et un aperçu des amplitudes des mouvements possibles de la protéine. La résonance magnétique nucléaire (RMN) permet de déterminer des structures protéiques et fournit également un grand nombre d’informations sur leurs propriétés dynamiques et de mesurer des propriétés physiques sur plusieurs échelles de temps caractéristiques (de la milliseconde à la seconde). Cette technique permet la localisation des protons dans les protéines, d’en déterminer le nombre et la disposition des couplages par liaison covalente et des couplages dipolaires .Il est possible d’enduire un modèle tridimentionnel. - La cristallographie aux rayons X est utilisée pour déterminer la structure des protéines et des informations sur la dynamique des protéines. La technique qui donne le plus de renseignements sur la structure spatiale. La diffusion et la diffraction des rayons X sont d’autant plus grandes que la densité électronique des atomes est élevée. Le très grand nombre d’atomes dans la molécule donne des spectres très complexes. La structure 3D d’une protéine peut fournir d’importantes informations sur la fonction de la protéine et son mécanisme d’action( bio cristallographie) . Pr M.SLIMANI

23 [ P ] + [ L ] [ P-L ] Ka= [ P- L ] / [ P ] x [ L ] = 1/Kd
7- Energie libre standard d'association/dissociation Définition de l’énergie libre Au cours d'une réaction enzymatique , des échanges d'énergie avec le milieu environnant ont lieu : certaines liaisons du substrat sont rompues en absorbant de l'énergie et les liaisons du produit sont formées en libérant de l'énergie. La stabilité d’un complexe peut-être mesurée en déterminant la constante d’association ka (en M−1 .s−1 ) et la constante de dissociation (en s−1 ) de la réaction. La constante de dissociation à l’équilibre Kd est directement reliée à l’énergie libre de Gibbs K1 [ P ] + [ L ] [ P-L ] Ka= [ P- L ] / [ P ] x [ L ] = 1/Kd Δ G = Δ G0 + RTln Ka le sens de la réaction Δ G < O : évolution dans le sens [ P-L ] Δ G > O évolution dans le sens de [ P ] et [ L ] Δ G =O équilibre ) ∆Gliaison = - RT log K a= RT log Kd ka =exp (- Δ G0 /RT) K2 ∆G° très négative ↔ association très favorable Pr M.SLIMANI

24 Pr M.SLIMANI

25 ∆G = G(Native) - G(Dénaturée)
La plupart des protéines repliées ont une stabilité assez faible car l’énergie libérée lors de la formation des centaines d’interactions faibles est presque exactement contrebalancée par l’énorme perte de flexibilité conformationnelle ( perte d’entropie) qui se produit lorsque les chaines repliées se replient en une structure compacte et ordonnée. Ces interactions faibles sont nombreuses et leur somme conduit à une diminution importante de l’énergie libre lors de la formation des structures secondaires et tertiaire Énergie libre et repliement des protéines Stabilité d’une protéine, mesurée par: ∆G = G(Native) - G(Dénaturée) La stabilité est définie comme une perte nette d’énergie libre , une fonction des effets combinés de l’entropie et de l’enthalpie. Une telle perte peut résulter principalement d’une perte d’enthalpie lors de la formation d’une liaison ou essentiellement d’un gain d’entropie lorsque le désordre d’un système ( une protéine) et de son environnement ( l’eau) augmente ou d’un équilibre entre les changements d’enthalpie et d’entropie. Pr M.SLIMANI

26 Δ G = Δ H - T Δ S Énergie intra- et inter-ligands
La protéine utilise une partie de l'enthalpie libre  de liaison associée à la fixation du premier ligand pour modifier sa conformation. Cette conformation modifiée a une géométrie plus favorable à la fixation du second ligand Energie totale= Energie d’interaction - désordre Enthalpie: ∆H caractérise la stabilité. Si ∆H<0 les produits sont plus stables que les réactants Entropie: ∆S caractérise le désordre: désordre de translocation et rotation des ligands . Si ∆S>0 les produits sont plus désordonnés que les réactants Δ G = Δ H - T Δ S Lorsque l’entropie d’un système thermodynamique augmente , ce système est moins ordonné. Inversement , une diminution de l’entropie reflète une augmentation de l’ordre. Plus un système est ordonné , plus il est organisé. Pr M.SLIMANI

27 1- Stéréo spécificité Ce processus de reconnaissance implique un haut degré de stéréo complémentarité structurale et électronique entre le ligand et le récepteur par lequel il agit avec des interactions par des liaisons faibles. 1-1 la stéréo complémentarité structurale : qui est la cause de la spécificité de l’action de la molécule informative. La stéréro-spécificité d’un site récepteur correspond à l’ensemble des groupements chimiques et des conformations structurales nécessaires à la fixation d’un ligand sur un récepteur . L’encombrement stérique(structure ) sont spécifiquement adaptés à la reconnaissance du (ou des) ligand(s). conditions d’interactions ligand-récepteur : Critères d’identification d’un récepteur  Ligand Récepteur Complémentarité structurale et électronique ligand-récepteur Pr M.SLIMANI

28 Structure de la noradrénaline et des stéréo isomères du propranolol
En effet , la structure spatiale des atomes peut avoir une conséquence sur l’activité du médicament qui comportent un carbone asymétrique, on peut avoir une activité sous la forme D et pas d’efficacité sous la forme L. Exemple : Les activités biologiques des deux énantiomères A et B du propranolol , un bêta-bloquant , ne sont pas les mêmes, l’énantiomère A possède un effet thérapeutique, alors que B est peu actif. Lors de la fixation du propranolol sur le récepteur, les acides aminés qui constituent le site actif se positionnent autour du propranolol pour adopter la conformation la plus stable. Or les interactions intermoléculaires qui s’établissent entre le stéréoi somère A et le récepteur sont plus nombreuses que celles qui s’établissent entre B et le récepteur Structure de la noradrénaline et des stéréo isomères du propranolol Pr M.SLIMANI

29 1-2 La configuration électronique :
il s’agit de la répartition des électrons dans une molécule , densité électronique. Cette densité électronique n’est pas uniforme : les électrons peuvent s’accumuler autour de certains atomes qui les attirent et augmentent ainsi leur charge négative, alors que d’autres atomes les repoussent et prennent une charge positive. Cette répartition de charge conditionne les interactions Une zone avec beaucoup d’électrons (zone nucléophile) réagit préférentiellement avec une zone à faible densité électronique (zone électrophile) et inversement Acetyl choline et le récepteur nicotinique Pr SLIMANI.M

30 2-Flexibilité – adaptabilité :
La liaison d’un ligand avec son récepteur provoque des changements de conformation du récepteur . Le changement de conformation donne aux molécules une flexibilité leur permettant de s'adapter les unes aux autres dans l'espace. On parle dans ce cas de conformations induites. Cette adaptabilité ou la flexibilité d’une protéine peut résulter, soit la transition d’un état à un autre sont nécessaires pour réguler l’activité, par exemple: le passage d’un état inactif à un état actif ou d’un état de faible affinité à un état de forte affinité ,soit de changements comme le déplacement de la chaîne latérale de quelques acides aminés pour lier un substrat. Exemple : - La liaison avec l'ion calcium induit un changement de conformation de la protéine et forme un complexe calcium-calmoduline (Ca2+-CaM) (une molécule de calmoduline pour quatre ions calciques) . Ce complexe permet l'activation, par changement de conformation, de nombreuses protéines, dont l'adénylate cyclase Pr M.SLIMANI

31 Le ligand peut se fixer sur des sites de liaison :
3-Saturabilité Le ligand peut se fixer sur des sites de liaison : -Spécifique (LS) : liaison à forte affinité, saturable ; nombre de sites de liaison spécifique limité (récepteur) -Non-spécifique (LNS) : affinité faible, non saturables ; nombre de sites de liaison non-spécifique illimité Liaison spécifique = Liaison Totale – Liaison non spécifique ( voire technique de Binding) 4- Réversibilité Interaction ligand –récepteur fait appel à différents types d’interactions  : interactions de van der Waals, hydrophobes , liaisons hydrogène et électrostatiques. L’interaction est réversible et plus ou moins forte suivant le nombre et la nature des liaisons formées. les vitesses d'association et de dissociation (Kd) peuvent être très différentes La force de cette interaction est définie par la constante de dissociation. Exemple : Un médicament ayant une vitesse d'association élevée et une vitesse de dissociation lente aura des effets rapides et prolongés. Pr M.SLIMANI

32 [P ]+ [L ] [P-L ] kd = [P ]x [L ] / [P-L] = K-1/K1
5-Affinité l’affinité des récepteurs pour leur ligand qui est également une caractéristique importante déterminant l’interaction du ligand avec son récepteur. L’interaction d’une molécule informative avec son récepteur est une réaction réversible ne mettant pas en jeu de liaisons covalentes. K1 [P ]+ [L ] [P-L ] kd = [P ]x [L ] / [P-L] = K-1/K1 K-1 La mesure de la fixation d’un ligand pour un récepteur Ka = 1/Kd Plus l’affinité est élevée , plus le site est spécifique Pr M.SLIMANI

33 Mécanismes des interactions ligand-récepteur
Protéine à un site de fixation : La fixation à l'équilibre d'un ligand sur une protéine qui possède un site de fixation pour ce ligand est régie par un équilibre thermodynamique : [P] = concentration de la protéine libre, [L] = concentration de ligand libre, [P-L] = concentration de la protéine complexée. k1:constante cinétique d’association en M-1xmin-1 k-1:constante cinétique de dissociation en min-1 K+1 k-1 [ P ] + [ L ] [ PL ] [P][L]/[P-L] = K-1/K1 = Kd Kd ou KA ( ou KB) = K-1/K1 = [ P ] x [ L ] / [ P L ] Selon la nomenclature actuelle la constante de dissociation à l’équilibre KD est nommée KA pour les agonistes et KB pour les antagonistes Pr M.SLIMANI

34 Capacité de fixation (%)
KD caractérise la liaison du ligand avec son récepteur, c’est la concentration de ligand nécessaire pour obtenir la moitié de l’occupation des récepteurs Selon cette théorie, basée sur la loi d’action de masse, l’effet pharmacologique serait proportionnel au pourcentage de récepteurs occupés et l’effet maximal serait obtenu pour 100 % de récepteurs occupés. Capacité de fixation (%) Fixation maximale(Bmax) Bmax/2 Kd (C) ligand Variations de concentration de ligand fixé au récepteur en fonction du ligand libre Pr M.SLIMANI

35 [P-L] = [Pt] x ([L]/Kd+[L]), selon une loi hyperbolique :
En utilisant la relation de conservation de la protéine : ([Pt] = [P] + [P-L]) [Pt] = concentration totale de la protéine [P-L] = [Pt] x ([L]/Kd+[L]), selon une loi hyperbolique : On parle alors d'une saturation Michaelienne (par analogie avec l'équation de Michaelis donné pour la vitesse d'une réaction enzymatique). Notion de fonction de saturation : ([L]/Kd+[L]) : ne dépend que du rapport [L]/Kd qui varie entre 0 et 1, et renseigne sur le degré de saturation de la protéine, on l'appelle la fonction de saturation Ÿ. Sa valeur est égale à 0,5 (demi-saturation) quand la [L] libre ([L]0,5) est égale à Kd. représente alors la constante d'équilibre apparente que l'on peut définir entre le ligand libre, la somme des différentes espèces de protéine libre et la somme des différentes espèces complexées au ligand : Kd = (Σ[protéine libre])x[L libre]/Σ[protéine complexée] Pr M.SLIMANI

36 Linéarisation en faisant les inverses de la fonction de saturation:
fonction de saturation Y = ([L]/Kd+[L]) 1/Y = 1 +Kd(1/ [L] ) ( Pr M.SLIMANI

37 Protéines à plusieurs sites de fixation pour un ligand :
Si une protéine possède plusieurs sites de fixation pour un ligand, ces sites peuvent être indépendants (la fixation du ligand sur un site étant indépendante de l'état de saturation des autres sites ) ou dépendants. a) Sites indépendants et équivalents : Si une protéine possède n sites de fixation équivalents, la relation d'équilibre est vérifiée au niveau des sites : [sites libres ][L]/[sites occupés] = Kd Kd = constante de dissociation microscopique ou intrinsèque. En faisant intervenir la concentration des sites totaux, qui est égale à n fois la concentration de la protéine : [sites occupés] = [sites totaux] x [L]/(Kd+[L]) = n[Pt]x [L]/(Kd+[L]) = n [Pt] Ÿ. Pr M.SLIMANI

38 V = [sites occupés]/[Pt] = n [L]/(Kd+[L]) = n ý.
La fonction de saturation de l'ensemble des sites est égale à la fonction de saturation de chacun des sites. On définit aussi V, le nombre moyen de sites occupés par protéine : V = [sites occupés]/[Pt] = n [L]/(Kd+[L]) = n ý. Si [Pt] = la concentration de protéine, est connue, on peut déterminer n, le nombre de sites de fixation par molécule de protéine. Mais on peut aussi bien déterminer un nombre de sites par cellule, ou de moles de ligand lié par mg de protéine. La concentration de ligand lié est égale à la concentration de sites occupés. Elle augmente avec la concentration de ligand libre selon une loi hyperbolique pour atteindre une valeur limite quand tous les sites sont occupés : [ligand lié] = [ligand lié]max . [L]/([Kd+[L]). [ligand lié] et [ligand lié]max sont souvent appelées B ( bound) et Bmax : B = Bmax . [L]/(Kd+[L]) = Bmax.F /Kd +F F : concentration de ligand libre Pr M.SLIMANI

39 - Représentation de Klotz : 1/V = 1/n +(1/n Kd/[L]).
1) Sites équivalents : La concentration de ligand lié suit une loi hyperbolique en fonction de la concentration de ligand libre. Les méthodes de linéarisation permettent de vérifier graphiquement que l'on est en présence d'une simple hyperbole, et de déterminer les paramètres qui la caractérisent. Les deux représentations les plus couramment utilisées ont été décrites initialement pour lineariser l'expression de ([ligand lié]/[Pt]) en fonction de [L] : - Représentation de Klotz : 1/V = 1/n +(1/n Kd/[L]). Représentation de Scatchard : V/[L] = n/Kd - V/Kd. Tout paramètre proportionnel à V peut être utilisé dans ces représentations, la signification des intersections avec les axes des abscisses et des ordonnées étant modifiée. En particulier, on utilise souvent la représentation de " Scatchard" pour linéariser l'équation de [ligand lié ]en fonction de [L] : [ligand lié]/[L] = [ligand lié]max/Kd - [ligand lié]/Kd. Pr M.SLIMANI

40 2) Sites indépendants et non équivalents :
La représentation de Scatchard n'est plus linéaire, et il est très difficile de déterminer les valeurs de Bmaxi et de Kdi par des méthodes graphiques. Le principe d'une telle analyse peut se résumer ainsi : pour une concentration donnée de ligand libre, le ligand lié est la somme du ligand lié à chaque classe de sites. Dans la représentation de Scatchard, les données correspondent à la fixation sur une classe de sites s'alignent sur une droite caractéristique de la linéarisation de l'hyperbole. L'ensemble des points correspondent à une même concentration de ligand libre [L] et à différentes valeurs de [ligand lié] s'alignent, quant à eux, sur une droite passant par l'origine et de pente 1/[L]; déterminer à partir d'une représentation de Scatchard non linéaire, les paramètres de fixation sur chaque classe de sites consiste donc à définir les droites correspondent à chacune de ces classes qui permettent de retrouver la courbe originale lorsque l'on calcule, pour chaque concentration de ligand libre, la somme des concentrations de ligand lié à chaque classe de sites. Pr M.SLIMANI

41 Figure 4: Représentation selon Scatchard : B/F = f (B).
Quantifification Relation de Scatchard : permet une détermination plus précise de KD et Bmax Ordonnée : ligand lié (L*R) / ligand libre (L*) Abscisse : ligand lié (L*R) KD = (L*x (Bmax - L*R))/L*R L*R = (L*x (Bmax - L*R))/ KD en développant et en simplifiant : L*R = (Bmax x L*) / (L*+ KD) en réarrangeant : L*R / L* = (-1 / KD) L*R + (Bmax / KD) soit lié / libre = (-1 / KD) lié + (Bmax / KD) Y = ax b Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM. Plus KDest faible plus l’affinité du ligand pour le récepteur est élevée Le Bmax s'exprime en nombre de sites de liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines. Figure 4: Représentation selon Scatchard : B/F = f (B). Pr M.SLIMANI

42 Approche expérimentale :
caractérisation d’un récepteur par technique de liaison spécifique au récepteur (ou binding) Le binding, ou expérience de liaison, est une technique qui permet de détecter dans un broyat tissulaire un récepteur pour un ligand donné par l’utilisation de ligands (agoniste ou antagoniste) capable de se fixer sur un récepteur. Elle permet de définir l’affinité d’un nouveau ligand pour des sites de liaison spécifiques (récepteurs), c’est à dire la capacité de fixation du ligand à son récepteur. -La constante de dissociation Kd  peut être déterminée par deux types de méthodes d’étude de la liaison (binding) du ligand à son récepteur : les méthodes de saturation ( Kd et nombre de récepteurs ) et les méthodes de déplacement Pr M.SLIMANI

43 Méthode de saturation :Mesure de l’affinité d’un ligand radiomarqué
A partir d’un homogénat tissulaire ou d’une préparation cellulaire ou membranaire contenant le récepteur à étudier et une concentration connue d’un ligand radiomarqué (3H , 14C , 125I sont les isotopes radioactifs les plus utilisés), il est possible de définir une liaison totale qui correspond à la somme de la liaison du ligand à son récepteur (liaison spécifique à forte affinité) et à d’autres sites de Liaison à faible affinité (liaison non spécifique). La liaison non spécifique est mesurée en présence d’une quantité de ligand non radioactif (ligand froid) suffisante pour empêcher la fixation du ligand radioactif sur ses sites spécifiques. La liaison spécifique correspond à la différence entre liaison totale et liaison non spécifique et permet de définir l’affinité du ligand pour son récepteur. Lorsqu'il est utilisé en large excès devant le ligand radioactif, son effet inhibiteur compétitif se manifeste seulement vis-à-vis des sites spécifiques. Protéine + [Δ*] [Δ] en large excès …………. mesure la fixation non spécifique par la R*. Lorsque le ligand R* (Δ*) est utilisé seul, la fixation observée est égale à l'ensemble de fixation spécifique et non spécifique : on l'appelle fixation totale[R ]+ [L* ] [R-L* ] kd = [R ]x [L* ] / [R-L*] K1 k-1 K1 [R-L*]+[ L1] [R-L1 ] + [L*] Pr M.SLIMANI k-1

44 • Séparation : on élimine le marqueur libre par filtration
Incubation ligand radioactif (L*) avec le récepteur R (par ex sur des mb) • Séparation : on élimine le marqueur libre par filtration • Mesure radioactivité du marqueur lié k1 [L*R] [L*] +[ R] k-1 La liaison spécifique et non spécifique des ligands Pr M.SLIMANI

45 Détermination de la fixation spécifique par méthode de saturation :
Représentation de la liaison en fonction de la concentration initiale en ligand Détermination de la fixation spécifique par méthode de saturation : 1. Préparation riche en récepteurs + radioligand en concentration croissante : liaison totale 2. Préparation riche en récepteurs + ligand froid en surcharge + radioligand en concentration croissante : liaison non spécifique 3. On déduit la liaison spécifique Pr M.SLIMANI

46 [RL] = [RL*] = concentration de radioligand lié de manière spécifique
[L] = [L*] = concentration de radioligand libre. Ainsi, la représentation de [RL] (axe des ordonnées, y) en fonction de [L] (axe des abcisses, x) est une hyperbole [RL] = f ( [L] ) Pr M.SLIMANI

47 Log [L*] représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration initiale en ligand. Pr M.SLIMANI

48 Expériences de déplacement de la liaison à l'équilibre - Notions d'IC50 et de Ki :
Principe : -On utilise le déplacement d’un ligand connu marqué et ajouté au préalable sur une préparation de membrane contenant le récepteur à étudier. On détermine ainsi le Ki(constante de dissociation obtenue par inhibition de la fixation d’un ligand) . La mesure de la liaison spécifique à l'équilibre, d'une concentration donnée (en général égale au Kd) en ligand radiomarqué en présence d'une concentration variable et croissante de ligand froid (par ex. : à 10-5 M). Le ligand froid entre en compétition avec le ligand radioactif pour sa liaison au récepteur: compétition de la liaison à l'équilibre Cette technique permet de démontrer qu'un ligand froid, se lie à un récepteur. d'étudier la liaison d'un ligand de faible affinité pour un récepteur (il est plus facile de disposer d'un ligand froid en grande quantité, que d'un ligand radiomarqué). Mesure de l’affinité des ligands non-marqués Notion de compétition et de déplacement : Déplacement du ligand radio-marqué. Pr M.SLIMANI

49 1/2 Figure 5: Représentation de la liaison totale en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid. IC50: concentration en compétiteur inhibant 50% de la liaison du ligand Axe des y : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines. NB : la liaison totale n'est pas égale au Bmax car la concentration en radioligand n'est pas saturante. Pr M.SLIMANI

50 100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid.
Expériences de compétition de la liaison, à l'équilibre ( IC50 , Ki ) : Figure 6: Représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid. 100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid.  50 % : concentration en compétiteur froid qui déplace 50 % de la liaison spécifique en ligand radiomarqué ( = IC50). 0 % : liaison spécifique en présence d'un excès de compétiteur froid. Pr M.SLIMANI

51 Equation de Cheng et Prusoff :
Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la relation qu'il existe entre le Kd, le Ki et l'IC50 Ki = constante de dissociation à l'équilibre pour le compétiteur froid. Kd = constante de dissociation à l'équilibre pour le ligand radiomarqué (affinité). [L] = [L*] = concentration de radioligand libre. Kd représente donc bien la concentration en compétiteur froid qui se lie à 50 % des sites récepteurs Pr M.SLIMANI

52 III- Autres techniques :
Mesure des concentrations de ligand lié et de ligand libre : Plusieurs approches expérimentales sont possibles: elles utilisent en général la séparation physique du ligand libre et du ligand lié à la protéine. Ainsi lorsque l'on étudie la fixation d'un ligand sur des protéines membraneuse, on peut centrifuger (ou filtrer) le mélange. Le ligand libre se retrouve dans le surnageant (ou le filtrat), le ligand lié dans le culot (ou le filtre). Si l'on travaille avec des protéines solubles, et que l'on étudie la fixation de petits ligands, on peut utiliser la filtration sur tamis moléculaire ou la dialyse à l'équilibre. La filtration sur une colonne de tamis moléculaire utilise les différences de migration des grosses molécules (la protéine avec ou sans ligand lié) et des petites molécules (le ligand libre). Pr M.SLIMANI

53 La chromatographie d'affinité
Elle est basée sur des interactions spécifiques entre deux molécules comme une protéine et son ligand. Dans une colonne on fixe sur un support inerte de façon covalente un ligand. On fait passer dans la colonne une solution contenant plusieurs protéines. La formation d'un complexe stable mais réversible permet de déterminer la protéine ayant de l'affinité pour ce ligand. Molécule à purifier + ligand spécifique-matrice insoluble ↔ Molécule-ligand-matrice insoluble La protéine recherchée ayant une affinité pour le ligand se fixera et sera immobilisée 1èr Lavage pour enlever les autres protéines 2ème lavage pour éluer la protéine fixée Pr M.SLIMANI

54 La dialyse permet de séparer des substances en utilisant leur capacité à franchir les pores d’une membrane semi perméable : membrane de dialyse . Les membranes de dialyse se présentent sous forme de cylindres allongés (boudin de dialyse ) qu’il faut fermer aux deux extrémités et qui contiennent le liquide à dialyser. Les macromolécules comme les protéines sont retenues dans le sac. Les protéines ne sont pas dialysables. Par la suite, on observera le phénomène d'osmose : les petites molécules passeront la membrane dans un sens permettant l'équilibre des concentrations de part et d'autre de la membrane du sac. Au début de la dialyse A l’équilibre Sac à dialyse Tampon Solution concentrée Pr M.SLIMANI

55 Le ligand est placé dans une des chambres, et la protéine est placée dans l’autre. Lorsque le ligand diffuse à travers la membrane, une partie des ligands est susceptible d’interagir avec la protéine. Cette diffusion ainsi que la fixation du ligand à la protéine continuera jusqu’à l’équilibre où la concentration en ligand libre dans les deux chambres est la même. la concentration de ligand fixé à la protéine peut alors être déterminée en soustrayant la valeur connue de [L libre] de la concentration totale de ligand mesurée dans le compartiment contenant la protéine. Pr M.SLIMANI

56 La détermination de la [ligand lié] et de [ligand libre] peut se faire indirectement, en étudiant un paramètre expérimental qui varie lorsque le ligand passe de l'état libre à l'état lié. Exemple: la fluorescence d'un coenzyme libre peut être comparée à la fluorescence de ce coenzyme lorsqu'il est en présence d'une concentration saturante d'apoenzyme. Connaissant ces deux paramètres, on peut, pour différentes concentrations d'apoenzyme calculer la concentration de coenzyme libre et de coenzyme lié. Ultrafiltration: Il s’agit d’une méthode de concentration / séparation des macromolécules biologiques basée sur leurs différences de taille et de forme qui utilise des membranes semi-perméables (tamisage moléculaire). l'extrait protéique est filtré sous pression d'azote à travers un filtre de cellulose à pores sélectifs .On trouve des membranes d’ultrafiltration dont les pores sont de diamètres différents, ce qui permet de séparer ainsi les macromolécules de tailles différentes. Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

57 Ultracentrifugation analytique :
Cette méthode consiste à mesurer la vitesse de sédimentation d'une molécule en fonction de sa conformation (libre ou liée), en réponse à une force centrifuge de à rpm..Les principales informations qu'elle apporte concernent l'homogénéité (en masse et en conformation) des échantillons, la formation d'agrégats et d'interactions fortes avec des ligands. Elle permet d'estimer des masses moléculaires et la détermination de stœchiométries. Les méthodes spectroscopiques : Les propriétés spectrales des protéines dépendent de leur composition en acides aminés mais aussi de l’environnement de ces acides aminés. Ces méthodes spectroscopiques sont basées sur le changement de propriétés spectroscopiques des protéines lors de la fixation d’un ligand. La protéine avec ligand présente donc un spectre différent de la protéine libre . De ces différences on peut remonter aux concentrations en protéines libres et avec ligands et donc aux constantes d’équilibre. Pr M.SLIMANI

58 Fluorimétrie : Une molécule fluorescente, ou fluorophore, possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (excitation) et de la restituer (émission) à une longueur d'onde spécifique. Les protéines possèdent une fluorescence intrinsèque lorsqu'elles possèdent des résidus tryptophane. - Il est également possible de greffer des fluorophores (fluorescéine, rhodamine...) pour pallier l'absence de tryptophane ou d’augmenter la sensibilité de la détection, qui sont fixés de façon covalente sur les résidus lysine et cystéine des protéines. L’étude des interactions protéine-ligand par fluorimétrie repose sur le changement des spectres d’émission des fluorophores dans la protéine lors de la fixation d’un ligand à proximité des fluorophores . Une molécule de petite taille (ligand) en solution possède un grand degré de liberté. Lorsqu'on lui soumet un rayonnement lumineux polarisé, la lumière réémise est alors dépolarisée. Par contre, si cette petite molécule se lie à une protéine, ses mouvements sont ralentis et la lumière réémise est moins dépolarisée. La différence entre ces deux états, directement liée à la concentration en protéine, est corrélable au nombre de protéines liées ainsi qu'aux constantes d'interaction. Pr M.SLIMANI

59 Principe de la fluorimétrie pour l’études d’interaction protéine- ligand.
Dans le schéma de droite, on constate que l’énergie du photon absorbé est susceptible d’être transférée du tryptophane vers le ligand fixé, ce qui conduit à un Quench de la fluorescence et donc à une réduction de l’intensité de la fluorescence du tryptophane en présence de ligand.(Daubenfeld.T,2006) Pr M.SLIMANI

60 -La polarisation de fluorescence La fluorescence résolue en temps
-Le  transfert d'énergie entre molécules fluorescentes  (FRET, fluorescence resonance energy transfer) : Cette technique permet de mesurer les distances (de quelques dizaines d’angström) séparant les fluorophores, et de très faibles variations de celles-ci. Elle est utilisé en imagerie cellulaire pour rechercher des interactions moléculaires .Les fluorophores sont portés par deux molécules différentes ; un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur ,de leur association ou de leur dissociation résultera une variation du signal de FRET. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules. Autres techniques : -La polarisation de fluorescence La fluorescence résolue en temps La microscopie de fluorescence Pr M.SLIMANI

61 Le dichroïsme circulaire : est une spectroscopie d’absorption dans l’UV qui mesure la différence d’absorption pour un composé chiral de la lumière polarisée circulairement gauche et de la lumière polarisée circulairement droite et ceci, en fonction de la longueur d’onde (dans la gamme de nm). L’activité optique peut être détectée soit par la variation différentielle de la vitesse de deux faisceaux (l’un polarisé circulairement à gauche, l’autre circulairement à droite) traversant l’échantillon, correspondant à la dispersion rotatoire optique . Cette technique est utilisée pour la détermination des structures secondaires des macromolécules biologiques en solution ainsi que pour les interactions protéine/ligand. Lorsqu’ un ligand interagit avec une protéine, il acquiert un dichroïsme circulaire induit( ICD), à travers la perturbation chirale de sa propre structure. Les longueurs d’onde de ce spectre ICD sont déterminées par le spectre d’absorption du ligand lui-même et l’intensité de ce signal est issu de la force de l’interaction avec la protéine et donc de son affinité. De ce fait, des analyses ICD peuvent être utilisées pour explorer les interactions d’un ligand avec une protéine. Pr M.SLIMANI

62 Analyse calorimétrique par dosage isotherme
L’analyse colorimétrique par dosage isotherme est une technique permettant la mesure directe des constantes d’interaction par une méthode thermochimique. L’interaction entre une protéine et un ligand est soit exothermique, soit endothermique. L’ajout d’un ligand dans une solution contenant la protéine libre va ainsi soit libérer soit absorber de la chaleur. Cette quantité de chaleur peut être mesurée par un calorimètre et donne accès directement à l’enthalpie libre d’association, qui est liée à la constante d’interaction . Cette technique donne également le nombre de sites d’interaction et une mesure de la coopérativité. Pr M.SLIMANI

63 Schéma du principe de l’analyse colorimétrique par dosage isotherme en haut
-La partie du bas représente la mesure du chauffage à apporter lors de l’ajout ‘une solution contenant le ligand. C’est à partir de ces données colorimétriques que sont calculés les paramètres thermochimiques de la réaction (Daubenfeld.T,2006). Pr M.SLIMANI

64 Résonance magnétique nucléaire :
La résonance magnétique nucléaire (RMN) , la méthode d'analyse s qui donne des renseignements sur les structures tertiaires. Les sites d'interaction sont déterminés par la modification des signaux de la protéine lors de l'ajout de ligands . Lors de la fixation d’un ligand sur une protéine, plusieurs paramètres qui influencent les spectres RMN sont susceptibles de changer : les déplacements chimiques ainsi que les vitesses de relaxation et de diffusion . Il est donc possible d’identifier les ligands qui se fixent sur la protéine ainsi que leur affinité pour la protéine. Les concentrations de protéine utilisées sont de l’ordre de μM. Pr M.SLIMANI

65 Electrophorèse capillaire d’affinité :
L'électrophorèse capillaire (CE) est une méthode séparative qui repose sur la séparation de molécules au sein d'un micro-capillaire soumis à un champ électrique. Cette technique permet la détermination des paramètres d’interactions de biomolécules (constantes de compléxation et stœchiométrie) . L’électrophorèse capillaire d’affinité est une technique particulière d’électrophorèse capillaire permettant d’obtenir des constantes d’équilibre. Cette méthode est basée sur les différences de vitesses de migration d’une protéine libre par rapport à la protéine en complexe avec un ligand dans un champ électrique. La mobilité électrophorétique (μ) d’une protéine est associée à sa masse moléculaire (M) et à sa charge (Z) .Le complexe protéine-ligand va migrer à une vitesse différente de celle de la protéine libre. La mesure des temps de migration en fonction de la concentration en ligand permet d’obtenir des informations sur Kd . Pr M.SLIMANI

66 Electrophorèse Capillaire
Dans cette technique, le gel classique est remplacé par un tube capillaire ouvert à ses extrémités, en verre de silice de très faible diamètre (30 à 100 µm) d'une longueur variant de 0,3 à 1 m et rempli d'une solution tampon. Les extrémités plongent dans deux réservoirs d'électrolyte, auxquels on applique une différence de potentiel pouvant atteindre 30 kV pendant le temps nécessaire. Un détecteur est placé un peu avant l'extrémité du capillaire . Pr M.SLIMANI

67 Autoradiographie des récepteurs :
L’autoradiographie est une technique permettant de localiser des molécules sur une préparation microscopique. La molécule qu’on recherche va être marquée par certains isotopes radioactifs,. utilise l’imagerie par rayons X, ou l’imagerie numérique par plaque au phosphore pour visualiser les molécules radiomarqués en enregistrant le rayonnement émis au sein de l’objet étudié. On réalise une préparation microscopique que l’on dispose sur un film photographique argentique. Celui-ci est impressionné par le rayonnement radioactif. Après développement du film on observe des points noirs sur les clichés aux endroits où se trouvent les molécules marquées , représente la quantité de radioactivité fixée sur le récepteur . Pr M.SLIMANI

68 ENZYMES ALLOSTERIQUES 1-Définition
Le terme allostérique vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques ont une structure quaternaire ,ce sont des protéines complexes composée de plusieurs sous-unités. Souvent leurs sous unités sont disposées de manière à ce que la molécule ait un axe de symétrie. Chaque sous unité peut fixer une molécule de substrat. Il existe au moins un site de fixation pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un modulateur (site régulateur). Les enzymes allostériques prennent une autre conformation à la suite de la liaison du modulateur Pr M.SLIMANI

69 2-Propriétés des enzymes allostériques : Cinétique des E allostériques
- Vitesse en fonction de [S] Les enzymes allostériques se distinguent des autres enzymes (michaeliens) par leur courbe v=f(S) qui n’est pas une hyperbole correspond à l’équation Michaelis Menten , mais une courbe sigmoide . Une cinétique sigmoïde reflète en général des interactions coopératives entre plusieurs sous unités protéiques . Pr M.SLIMANI

70 Effet de coopérativité :
Cette propriété de coopérativité des protomères donne un avantage aux systèmes allostériques par rapport aux enzymes à cinétique michaelienne pour la régulation de la vitesse des réactions enzymatiques Effet de coopérativité : la coopérativité traduit le fait que la fixation sur l'enzyme d'une molécule d'un effecteur allostérique influe sur la fixation des molécules suivantes. Dans le cas de coopérativité en présence du substrat: -Si l'effecteur allostérique est le substrat lui même on parle de modulation homotrope :interactions entre des ligands identiques - Si l'effecteur est différent du substrat on parle de modulation hétérotrope: interaction entre différents ligands -Dans une coopérativité positive, une molécule d'un effecteur entraîne l'augmentation de l'affinité pour les mêmes molécules et vice versa pour une coopérativité négative Pr M.SLIMANI

71 Formalisme de Hill L'équation de Hill concerne le cas particulier de la fixation d'un même ligand sur plusieurs sites d'une protéine oligomérique possédant un site de fixation sur chaque monomère. L’équation exprime le degré de saturation d’une protéine oligomérique en fonction de la concentration en ligand Ys: la fraction des sites comportant un ligand lié, [L] est la concentration de ligand et Kd est la constante de dissociation apparente. La constante n s'appelle la constante de Hill , décrit le degré de coopérativité de la fixation du ligand n : paramètre qui dépend du degré de coopérativité entre les sites de liaison du ligand en interaction la constante de Hill (n) augmente avec le degré de coopérativité d’une réaction Pr M.SLIMANI

72 Quand l’enzyme n’est pas michaelienne, le graphe V = F([S]) n’est pas hyperbolique (cas des enzymes allostériques, n > 1 ou n < 1 Pr M.SLIMANI

73 Si n=1, hyperbole ; la liaison de ligand : non coopérative
Si n=1, hyperbole ; la liaison de ligand : non coopérative. L'équation de Hill se réduit alors à une fixation simple, comme dans l'équation de Michaelis-Menten. Si n>1 :coopérativité positive : la liaison du ligand augmente l’affinité de E pour les liaisons du ligand ultérieures .La coopérativité se traduit par une courbe de saturation de forme sigmoïde, d'autant plus marquée que la coopérativité est forte Si n < 1: coopérativité négative : la liaison du ligand diminue l’affinité de E pour les liaisons ultérieures du ligand: la fixation est anticoopérative. Pr M.SLIMANI

74 . myoglobine (Mb) : 100% de saturation signifie 1 O2 pour une Mb,
Exemple : hémoglobine (Hb): 100% de saturation signifie 4 O2 par Hb α2β2 , La courbe de saturation de Hb possède une allure sigmoïde . myoglobine (Mb) : 100% de saturation signifie 1 O2 pour une Mb, la courbe de saturation de Mb est une hyperbole classique Hb :Si une première molécule de O2 se fixe sur une chaîne α, elle va induire un mouvement conformationnel global. Et en fait ce mouvement va se répercuter essentiellement sur la deuxième chaîne α qui va voir son affinité pour O2 fortement augmentée. • Quand les 2 chaînes α ont lié chacune un O2, l'induction de changement conformationnel fait passer les 2 chaînes β en conformation à très très haute affinité pour O2. L'Hb se sature alors en O2 O2 exerce un effet coopératif positif sur sa propre fixation (l'affinité s'améliore avec la première fixation). La courbe sigmoïde de saturation est une conséquence directe de ce phénomène. Pr M.SLIMANI

75 Courbe hyperbole La courbe sigmoïde
la courbe de la liaison de l’oxygène à la myoglobine est hyperbolique tandis que la courbe de saturation décrivant la liaison de l’oxygène à l’hémoglobine est sigmoïde Pr M.SLIMANI

76 R: relâché T : tendu Modélisation : I S
Deux modèles relatifs à la coopérativité existent : 1 -La transition concertée de Monod, Wyman et Changeux (MWC) : modèle symétrique.(1965) - Enzyme allostérique : oligomères (plusieurs sous-unités) - Chaque protomère (sous-unité) ne contient qu’un seul site pour un ligand -Les sous-unités (protomères) sont équivalentes afin que chaque oligomère possède au moins un axe de symétrie. -selon la théorie de l'allostérie chaque sous unité catalytique peut exister sous deux états conformationnels R ou T : -une forme T tendu (tense) à faible faible affinité pour le substrat (S) ou sous forme R : relâché ( relased ) à forte affinité pour le substrat . A l’origine, ces dénominations signifiaient respectivement relaxé et tendu, et découlaient de l’idée que la protéine devait se relaxer afin de fixer le substrat. - Ces états sont en équilibre et ceci indépendamment de la liaison d’un ligand à l’oligomère. I S R: relâché T : tendu Pr M.SLIMANI Pr.M SLIMANI

77 A ou S R T I Modèle symétrique (MWC)
Lorsque l’énergie interne d’un protomère augmente par suite de la modification de ces liaisons, on dit qu’il passe à un état tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposent une structure correspondant à une énergie interne diminuée, on dit qu’il passe à un état relâché. A ou S R Relâché :Actif T Tendu :inactif I c'est la fixation du ligand qui modifie l'équilibre entre les formes R et T. -En présence du substrat , l’équilibre est déplacé vers R  -Un effecteur activateur favorisera le maintien de la forme R de l'enzyme. -En l’absence du substrat , l’équilibre est en faveur de T -Un effecteur inhibiteur favorisera le maintien de la forme T de l'enzyme Pr M.SLIMANI

78 S S S S - -En absence du substrat , l’équilibre est en faveur de T et en présence de substrat ,équilibre vers R : Les molécules de ligand se fixent donc de préférence à R, ce qui déplace l’équilibre vers l’état R. La transition se produit en bloc -une coopération entre les protomères pour que le substrat soit plus efficacement transformé. Pr M.SLIMANI

79 2-MODÈLE SÉQUENTIEL Le modèle séquentiel ou modèle KNF (Koshland, Nemethy, Filmer,1966 ) est fondé sur la notion qu’une protéine est suffisamment flexible pour que la liaison d’un ligand au niveau d’un site modifie directement la conformation d’un autre site de la molécule protéique et affecte l’affinité de ce dernier site pour son ligand. En absence du substrat , toutes les molécules d’enzymes sont en conformation T. La fixation de la première molécule de substrat induit la transition T --- R de la première sous unité ce qui facilite la transition T R de la sous unité voisine et la fixation d’une deuxième molécule de substrat , et ainsi de suite pour une molécule d’enzyme (sous unité par sous unité). Ces changements et leurs effets sur l’affinité des sites apparaissent séquentiellement, au fur et à mesure que les ligands se fixent Le couplage entre les sous unités n’est pas nécessairement assez fort pour préserver la symétrie de l’oligomère comme c’est le cas dans le modèle symétrique. S S S S S S S S S S S S S S Relâché Tendu Pr M.SLIMANI

80 Action des effecteurs allostériques
Activateurs allostériques Activateur allostérique déplace l’équilibre T -----R vers R : l’affinité de l’enzyme pour le substrat est augmenté, la K0.5 est diminué , La courbe v=f(S) est déplacée vers la gauche inhibiteurs allostériques Un inhibiteur allostérique déplace l’équilibre T--- R vers T : l’affinité de l’enzyme pour le substrat est diminué , la K0.5 est augmentée, la courbe v=f(S) est déplacée vers la droite .L’inhibition allostérique est un phénomène hétérotrope négatif Exemple : l’aspartate transcarbamylase, inhibée par le CTP (cytidine triphosphate ) , est activée spécifiquement par l’ATP. Pr M.SLIMANI

81 R T I A ou S Modulations allostériques de types K et V :
Les enzymes allostériques peuvent être distingués selon les effets exercés sur elles par les effecteurs homotropes et hétérotropes qui les concernent. Ainsi, on distingue: 1-Les enzymes du système K (K est le symbole de la constante d'affinité ) où l'effecteur ne modifie que l'affinité apparente (K 1/2 équivalent Km) de l'enzyme pour le substrat. A ou S R Relâché :Actif T Tendu :inactif I Effet coopératif homotrope positif : le substrat facilite sa propre fixation Pr M.SLIMANI Effet héterotrope

82 Activateur et inhibiteur modifient la vitesse (Vmax) sans modifier K
2- Les enzymes du système V où l'effecteur ne modifie que la vitesse maximale (Vmax) de la réaction. Activateur et inhibiteur modifient la vitesse (Vmax) sans modifier K +Activateur +Inhibiteur coopératif positif : augmentation de l’affinité coopératif négatif ( diminution de l’affinité) Pr M.SLIMANI

83 Importance des enzymes allostériques
Ont un rôle de régulation très important dans la cellule: En général l’enzyme allostérique catalyse la 1ère réaction, limitante d’une voie métabolique .Son activité peut être contrôlée par des activateurs ou inhibiteurs appartenant à cette voie métabolique permettent l’adaptation du métabolisme au besoin de la cellule. A le substrat de E1 enzyme clé, allostérique, est un modulateur positif (= activateur allostérique, il active l’enzyme) et X, le produit final est un modulateur négatif (= inhibiteur allostérique, il inhibe l’enzyme), chaque fois qu’il se trouve en excès par rapport aux besoins. Ce type de régulation est appelée rétrocontrôle (inhibition par «feed-back »). Exemple : l’aspartate transcarba-mylase est le premier enzyme d’une voie conduisant en six étapes à la synthèse du cytidine triphosphate (CTP) ; elle est inhibée par ce dernier. La thréonine désaminase intervient dans la première réaction de la voie conduisant de la thréonine à l’isoleucine ; elle est inhibée par cette dernière. Pr M.SLIMANI

84 Exemple d’allostérie : l’hexokinase
L’hexokinase est une enzyme de la membrane plasmique : catalyse une réaction de transfert de phosphate et d’énergie du coenzyme ATP vers le glucose qu’elle active en glucose-6-phosphate. Un proton est libéré. • La réaction couplée est exergonique et irréversible. • Le glucose-6-phosphate, produit de la réaction catalysée, est en outre un régulateur allostérique de l’hexokinase. Il se fixe sur un site de liaison différent du site actif et cette fixation diminue l’affinité du site actif pour le glucose. Il en résulte un ralentissement de la vitesse de réaction. Pr M.SLIMANI

85 Unité de l’activité enzymatique
-L’unité enzymatique est la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une certaine quantité de substrat par unité de temps. -l’unité internationale (UI)/ la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mmole de substrat par minute 1UI= 16nKat. -lekatal (kat) : la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une mole de substrat par seconde (les sous-multiples sont seuls utilisés : millikatal, microkatal et nanokatal). (1 UI = 1 μmol.min–1= 10–6/60 mol.sec–1= 10–6/60 kat = 0,01667 μkat = 16,67 nkat) 60 IU valent donc 1 µkat - Constante catalytique kcat (ou k2) :représente la fréquence à laquelle l'enzyme accomplit l'acte catalytique ,lorsque l'enzyme est saturé en k cat = Vmax/ [E] o -1/ kcat : la durée d'un cycle catalytique lorsque l'enzyme est saturé en substrat. -La valeur de kcat donne la mesure de l'efficacité de la catalyse par l'enzyme sur le substrat. -Constante de spécificité: Rsp = kcat/ Km , reflète la spécificité globale d'un enzyme vis à vis d'un substrat Pr M.SLIMANI

86 -ANTONIOTTI .S, cours de biocatalyse ,2007
Références Anne-Lise MARIE, « Electrophorèse capillaire couplée ou non à la spectrométrie de masse pour l’évaluation ou le contrôle qualité de protéines à visée thérapeutique », THESE DE DOCTORAT, UNIVERSITE PARIS-SACLAY,2015 -ANTONIOTTI .S, cours de biocatalyse ,2007 - BAUDIN.B Méthodes de mesure des activités enzymatiques,2013 -BECKER H ; Eléments de biochimie : Notions d’enzymologie -BENDAVID .C,2009, Enzymes et coenzymes -CHIBRAOUI Layachi et KABBACH Wafae, Enzymologie, -COLLAS .Ph : Enzymologie théorique -CORNISH-BOWDEN .A , JAMIN.M et SAKS.V , cinétique enzymatique ,2005 -DELAHAYE .A, Enzymologie, DAUBENFELD.T , Etude de complexes protéiques non covalents par spectrométrie de masse FT-ICR., Thèse de Doctorat , Ecole polytechnique, France , 2006 -GARETT et GRISHAM ,2000, Biochimie ,Edts De Boeck Université s.a (Paris, France) Pr M.SLIMANI

87 -KEILLOR.J.W, Inhibitions des réactions enzymatiques ,2004
KARP, 2004 , biologie cellulaire &moléculaire , édts De Boeck& Larcier s.a Université (Bruxelles , Belgique) -KEILLOR.J.W, Inhibitions des réactions enzymatiques ,2004 -PAPY –GARCIA.D et GARRIGUE ANTAR.L , Cinétique enzymatique -Petsko Ringe ,2009 , structure et fonction des protéines , Edts De Boeck Université(Bruxelles, Belgique). -Pierre van de Weghe , les interactions protéine –ligand «  règles de Lipinski et drugabilité -RAISONNIER .A, 2002,Enzymologie élémentair -Simonson.S, Ingénierie des BioMolécules Module Bioinformatique Structurale Novembre 2013 -TOUSSAINT B., Les enzymes,2011 -VOET.D et VOET.J.G, 2005, Biochimie , Edts Boeck&Larcier s.a ( Bruxelles , Belgique) -WEINMAN .S et MEHUL.P , Toute la biochimie, ed. Dunod, Paris, 2004 Pr M.SLIMANI