Sensitive and specific detection of almond (Prunus dulcis) in commercial food products by real-time PCR ADLI Mahdi GARDETTE Marion MERCIER Fanny.

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1 Sensitive and specific detection of almond (Prunus dulcis) in commercial food products by real-time PCR ADLI Mahdi GARDETTE Marion MERCIER Fanny

2 Introduction Matériels et méthodeRésultats Amande Effet nutritif positif : - baisse taux cholestérol - protection contre diabète Utilisation dans de nb produit Entre 1997 et 2007: Production x 2 = 2 019 million tonnes A dose minimale : Réponse immunologique anormale  Choc anaphylactique Souvent ingestion accidentelle Sur 11 ans : augmentation allergie de 1,3% chez adulte 2,1% chez l’enfant

3  Lignes directives 1169/2011/EC : obligation de mentionner si présence d’amandes et autres composants allergiques  Développement d’une méthode de détection de présence d’amandes dans les aliments par PCR- RT en recherchant le gène ITS1 Introduction Matériels et méthodeRésultats

4 Sélection des échantillons 35 cultivars d'amandier différents (feuilles et noyaux simples) 4 variétés commerciales ( noyaux simple ) Introduction Matériels et méthodeRésultats Extraction d’ADN kit de système de nettoyage d'ADN Wizard (Promega) : extractions rapides à l'aide de réactifs prêts à l'emploi électrophorèse sur gel d’agarose

5 Amorces oligonucléotidiques et sondes  Séquençage de la gène de séquence ITS pour l’allergène cible Introduction Matériels et méthodeRésultats

6 Hybridation 60 °C Elongation 40 °C Dénaturation 95 °C Introduction Matériels et méthodeRésultats

7 PCR en temps réel basée sur la région ITS 1 Intérêts :  Amplification à partir de faibles quantité d’ADN  Augmentation sensibilité de la PCR  Grande variation de séquences  Différentiation d’espèces très proches Introduction Matériels et méthodeRésultats

8 de la PCR Réactions croisées possibles avec Prunus  35 espèces testées : pas d’amplification du système RT-PCR ITS 1  48 espèces de plantes et 4 animales : Amplification fragment de 76 pb pour l’amande seulement  35 variétés d’amandes cultivées et 4 sauvages : Amplification pour toutes les variétés Introduction Matériels et méthodeRésultats Vérification de la spécificité

9 Courbe de calibration Amandes brutes ou traitées thermiquement Mélange avec de la farine de blé Teneurs croissantes en amande Introduction Matériels et méthodeRésultats  Bonne sensibilité  Amplification fragments courts

10 Analyse des produits alimentaires 214 produits analysés :  28 contenant de l’amande dans les ingrédients  63 pouvant contenir des traces de noix  123 ne déclarant pas la présence de d’amandes  Résultats non concordants pour 50 produits n’indiquant pas la présence d’amandes Introduction Matériels et méthodeRésultats

11 Introduction Matériels et méthodeRésultats Quantification : Produits déclarant présence d’amandes : Facteurs affectant le rendement d’ADN : Dégradation ADN due au processus de fabrication Présence d’autres matrices alimentaires  ADN pouvant interférer avec la réaction de PCR Analyse des produits alimentaires  Quantité détectée inférieure à celle déclarée

12 Introduction Matériels et méthodeRésultats Quantification : Produits ne déclarant pas présence d’amandes : Quantification non fiable : indicateur de la présence d’allergènes dans le produit  Contamination au cours de la production  Problème de santé pour les individus sensibles Analyse des produits alimentaires Nombre d’échantillonsQuantité détectés (mg/kg) 40 <10 710-50 3>50

13 Conclusion Etiquetage pas toujours fiable  Danger potentiel PCR en temps réel sur ITS 1 : Bonne méthode :  Sensibilité élevée : détection jusqu’à 1 mg/kg  Applicable en routine pour contrôle qualité