Congélation et Décongélation du sperme équin Réalisé par: MAHOUDI Meryem Encadré par: Pr. Rachid BOUKHLIK.

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1 Congélation et Décongélation du sperme équin Réalisé par: MAHOUDI Meryem Encadré par: Pr. Rachid BOUKHLIK

2 Depuis une vingtaines d’années, la congélation du sperme équin à facilité la conservation dans le temps du patrimoine génétique des étalons et a permis de le répandre dans le monde entier.

3 Exemples de techniques: -congélation: diminution progressivement la température. (Risque de formation de cristaux intracellulaires est élevé  recours à de fortes concentrations d’agent cryoprotecteur) -vitrification: diminution brutale de la température. (Pas de cristallisation intracellulaire mais risque de dénaturation des protéines)

4 ETAPES DE LA CONGELATION

5 Récolte du sperme La récolte se fait en salle de monte et nécessite l’utilisation d’un mannequin (qu’on appelle aussi fantôme). Préparer le matériel: vagin artificiel lubrifié et chauffé avec l’eau, avec une fiole fixée au bout pour recevoir le sperme. Le principe consiste à dévier la verge de l’étalon au moment de l’éjaculation et recueillir le sperme dans le vagin artificiel qui reproduit les conditions de température et de pression rencontrées naturellement dans le vagin de la jument. Les étalons sont prélevés tous les deux jours.

6 Après récolte : Sitôt recueilli, le sperme d'étalon doit être maintenu à l'abri de toute contamination, puis on filtre de le sperme pour enlever toutes les impuretés Le sperme est ensuite analysé pour déterminer ses caractéristiques (concentration en spermatozoïdes, mobilité globale et progressive) (SPERMOGRAMME 1) Exemple d’analyseurrésultats

7 Pré-dilution et centrifugation: Dilution du sperme pour une première fois avec un dilueur à base de lait ne contenant pas d’agents cryoprotecteurs le sperme de l’étalon est peu concentré comparé à d’autres espèces comme le bovin, ce qui fait que la centrifugation est primordiale:  Centrifugation simple de la semence à 600 G pendant 10 min : nécessaire pour enlever le plasma séminal (riche en acide citrique et en potassium) qui est toxique pour les spermatozoïdes.

8 Eliminer le surnageant et conserver le culot de centrifugation. Ce dernier contient les spermatozoïdes. Prélever un échantillon pour connaitre le nombre de spermatozoïdes qui ont résisté à la centrifugation afin d’ajuster la concentration à une valeur de 100 millions de spz/ml (sperme maintenu à 22°C )

9 Il existe d’autres protocoles utilisant des milieux coussins qui consistent à les ajouter au fond des tubes afin d’augmenter l’accélération de la centrifugeuse en évitant toutes lésions des spermatozoïdes. On obtient donc à la fin plus de paillettes par éjaculat (récupération de 90% des spz comparé à 60% pour la technique de centrifugation simple) la centrifugation sur des milieux colloïdaux est utilisée surtout chez les étalons dont la qualité de sperme est faible puisqu’elle permet de piéger les spermatozoïdes anormaux, les bactéries et les décrits cellulaires afin de les séparer des spermatozoïdes mobiles et fertiles. Cependant, la production de paillettes diminue vue qu’il y a une grande perte de spermatozoïdes.

10 Tableau comparatif de différents protocoles de centrifugations:

11 Rajouter le dilueur de congélation qui est normalement à base de lait contenant des cryoprotecteurs. L’agent cryoprotecteur utilisé pour la congélation est le glycérol dont la concentration ne doit pas dépasser 3,5% du volume total. Il existe même un milieu de congélation ne contenant qu’une concentration de 2,5% et qui donne d’excellents résultats. Dilueur de congélation

12 Phase d’équilibration amener la semence tout doucement d’une T° ambiante de 22°C à 4°C ce qui permettra aux cryoprotecteurs qui se trouvent dans le dilueur d’entourer toutes les cellules des spermatozoïdes de façons à les protéger lors de la congélation. L’agent cryoprotecteur utilisé pour la congélation est le glycérol dont la concentration ne doit pas dépasser 3,5% du volume total. Il existe même un milieu de congélation ne contenant qu’une concentration de 2,5% et qui donne d’excellents résultats.

13 Conditionnement et Congélation : Une fois la semence est à 4°C (1h30) et une fois la mise en paillette(0,5ml) terminée, passer à l’étape de congélation horizontale : mettre les paillettes sur des raques horizontalement. Elles sont refroidies dans un congélateur électronique qui envoie des vapeurs d’azote pour atteindre -140°C, avec une pente variant, selon le milieu de congélation utilisé, entre -20°C et -60°C par minute. Les paillettes sont ensuite immergées et stockées dans l’azote liquide (-196°C).

14 Impression des paillettesmise en paillette

15 Congélation horizontale Réglage du congélateur Stockage de la semence dans l’azote liquide

16 Après quelques jours, la semence est analysée en prélevant deux ou trois paillettes au hasard et faire des analyses (SPERMOGRAMME 2)  Test de cryorésistance : 1. Méthode lente : Prélever un échantillon de sperme congelé. Plonger dans bain-marie à 38°C pendant 5h. Déterminer le % de spermatozoïdes mobiles 2. Méthode rapide : Prélever l'échantillon (> 20 h dans l'azote liquide) Maintenir au bain-marie à 46°C pendant 0.5 h. Déterminer le % de spermatozoïdes mobiles.

17 Chez le cheval, la mobilité progressive et la vitesse de la trajectoire moyenne (VAP) après décongélation sont corrélées avec la fertilité  normes des haras : 35% de spermatozoïdes vivants après la décongélation Si la qualité est conforme, les paillettes sont rangées dans des visotubes identifiés qui sont eux même rangés dans les canisters d'une "bonbonne" remplie d'azote liquide.

18 Chaque insémination nécessite le contenu de 8 paillettes de 0,5 ml à 50 millions de spermatozoïdes pour obtenir 400 millions de spermatozoïdes. La variabilité de la congélabilité de la semence entre étalons est grande.

19 On peut résumer les étapes de congélation comme suit: Dilution 1 Centrifugation Dilution 2 Réfrigération (90 min à 4°C) Mise en paillettes à 4°C Congélation jusqu’à -140°C à raison d’une perte de 20-60°C/min Stockage dans l’azote Contrôles qualité

20 Sperme congelé: avantages et inconvénients Avantages :  doses disponibles partout et n’importe quand  sécurité sanitaire  nombreuses doses par éjaculats Inconvénients :  coût de production  suivi de la jument  20% des étalons ont un sperme non « congelable » (qualité de la semence insuffisante après décongélation pour des raisons encore inconnues)

21 Le but de la congélation est d’augmenter la durée de conservation de la semence, sauf que l’exposition de ces dernières au froid peut induire: -un choc thermique  dénaturation de protéines -la cristallisation intracellulaire  lésions des organelles + déshydratation intracellulaire + dénaturation de protéines + accumulation de composés toxiques Il n’existe pas de technique de congélation idéale, chacune réduit certains risques mais en favorise d’autres.

22 Bibliographie: Congélation du sperme dans l’espèce équine : état des lieux et perspectives http://www.facmv.ulg.ac.be/amv/articles/2014_158_1_04.pdf http://www.facmv.ulg.ac.be/amv/articles/2014_158_1_04.pdf http://formavet.com/moodle/pluginfile.php/181/mod_resource/content/0/03_Congelati on_du_sperme.pdf http://formavet.com/moodle/pluginfile.php/181/mod_resource/content/0/03_Congelati on_du_sperme.pdf Collecte et traitement de la semence d’étalon : quoi de neuf ? (Isabelle Barrier Battut) http://www.lepointveterinaire.fr/publications/pratique-veterinaire-equine/archives/n- 177/collecte-et-traitement-de-la-semence-d-etalon-quoi-de-neuf.html http://www.lepointveterinaire.fr/publications/pratique-veterinaire-equine/archives/n- 177/collecte-et-traitement-de-la-semence-d-etalon-quoi-de-neuf.html http://www.equi-genetique.com/static/production-sperme-congele.html HARAS DES BREVIAIRES (78) - La récolte et la congélation - 19 Février 2015 https://www.youtube.com/watch?v=Bm7q9WsIiXE https://www.youtube.com/watch?v=Bm7q9WsIiXE http://webveto.centravet.net/Publication/Show.aspx?item=1641&code=PUB_HEREP