Jean-Clément Mars Étudiant au doctorat Laboratoire du docteur Tom Moss

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1 Jean-Clément Mars Étudiant au doctorat Laboratoire du docteur Tom Moss
Étude des mécanismes de régulation de la Transcription des ARN ribosomiques

2 Expression génique Le ribosome ARN Protéines ADN ARN Polymérase
Gène 1 Gène 2 Gène 3 ARN Polymérase Transcription Derrière se titre pompeux, se cache plus globalement l’expression génique. A savoir la production d’ARN à partir de l’ADN grâce à l’ARN polymérase qui TRANSCRIVE les gènes qui pourront ensuite être traduit en Protéine. Cette autre molécule s’appelle le ribosome et c’est sa production qui m’intéresse pour cette étude. Le ribosome ARN Traduction Protéines 2

3 ARN ribosomiques 82 protéines et 4 ARN ribosomiques
Croissance cellulaire Prolifération Différentiation Transformation cellulaire 82 protéines et 4 ARN ribosomiques Plus spécifiquement la production d’un de ses constituants, à savoir les ARN ribosomiques des ARN donc mais qui ne sont pas traduits en proteines. Ils sont au nombres de 4 et 3 d’entre eux sont issus d’un même gène: communément appelé ADNr. La production de ce gène est d’une importance capitale pour les cellules puisqu’elle est directement couplée à la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation mais également la transformation des cellules en cellules cancéreuses ce qui en fait une cible de choix pour de futurs traitements anticancéreux. 3 ARN issus d’un même gène 18S 5,8S 28S Terminateur Promoteur Spacer Promoteur ADN ribosomique 3

4 Mécanisme UBF remplace les histones?
À quoi sert le deuxième promoteur? De nombreuses protéines sont impliqués dans la production de ce gène, à commencer par UBF qui est fixé tout le long du gène en incluant les régions promotrices, il permet la reconnaissance et la fixation du facteur d‘initiation TIF-IB au promoteur puis le recrutement de RPI (la polymérase) par TIF-IA. TIF-IA est également impliqué dans l’initiation de la transcription par RPI qui va transcrire le gène jusqu’à la région de terminaison où TTF permet l’arrêt de la transcription. A ce modèle il faut rajouter certaines interrogations. La première est sur le remplacement des histones par UBF qui est une situation tout a fait exceptionnelle dans la transcription. La deuxième se porte sur l’utilité du Spacer promoter dont le rôle reste encore à déterminer. UBF est fixé tout le long du gène ainsi que sur les régions promotrices TIF-IB reconnait les régions promotrices TIF-IA recrute RPI RPI transcrit le gène TTF permet la terminaison de la transcription Nucléosome

5 Étude difficile de la régulation:
Méthodologie Immunoprécipitation de chromatine (ChIP): - Isoler une protéine d’intérêt en complexe avec ses séquences d’ADN cible - Observer les séquences associées (séquençage) Étude difficile de la régulation: 200 copies du gène 50% sont constitutivement réprimés Grande modulation possible au niveau de la transcription Afin d’étudier un peu plus en détails comment tout fonctionne j’utilise la technique de ChIP. Elle consiste à isoler spécifiquement des protéines en complexe avec leurs séquences d’ADN cibles grâce à la sonication de l’ADN et l’immunoprécipitation spécifique d’une protéine. Une fois isolées, on utilise des techniques pour observer les séquences comme le séquençage ou la PCR. Une difficulté supplémentaire dans le cadre de mon étude est la présence de 200 copies par cellule de ce gène dans différents etats: actifs, inactifs, transcrits, non transcrits. Ce qui entraine une interprétation délicate au niveau des résultats.

6 Cartographie RPI UBF Même profil retrouvé dans toutes les données
Normalisation possible par la forme Term

7 Normalisation Séquençage UBF TIF-IB RPI TIF-IA TTF H2Az
RPI est présent tout le long du rDNA UBF semble avoir une distribution non homogène TTF est en aval de RPI sur le Spacer Promoteur H2Az présente un signal fort en amont de cette zone Dans un premier temps, je me suis attelé à la cartographie précise de tous ces facteurs le long du gène d’ADN ribosomique grâce au séquençage haut débit. Les résultats de mes expériences montrent la localisation relative des facteurs les uns par rapport aux autres et confirment le modèle admis. En plus il montre un co-localisation précise d’UBF avec TIF-IB sur les zones promotrices, suggèrent que TIF-IA relâche progréssivement RPI au cour de l’initiation. L’absence de TIF-IA au sppr indiquerai la présence d’une polymérase bloquée en elongation (correspond au signal de chipseq) et la présene de ttf juste en aval confirme cette hypothèse. Curieusement on observe aussi un signal important d’une histone spéciale juste en amon du spacer promoter. Term SpPr Prom

8 ENCODE Données publiques/ Projet ENCODE UBF SMC3 SMC1 CTCF DNase
H3K27Ac CTCF SMC1 SMC3 H3K4Me3 H2Az Barrière protéique en amont du Spacer Promoteur Rôle d’exclusion des Nucléosomes Afin d’investir plus en détail les particularité architecturales de cette région, j’ai comparé mes donnés avec des données publiques du projet ENCODE. Sans entrer dans les détails, plus qu’uniquement une histones, de nombreuses marque sont retrouvés juste en amon de protéines architecturales: les cohésines ainsi que CTCF facteur bien connu de modulation transcriptionelle. Promoteur Spacer Promoteur

9 Conclusions UBF non homogène
En guise de conclusion mes travaux ont permis de préciser le modèle communément admis grace à la cartographie de certains acteurs de la transcription, une remise en cause du modèle de distribution homogène d’UBF. Tous ces travaux permettent de mettre à jour deux nouvelles hypothèses. La première est sur le rôle du spacer promoter et la présence de RPI à ce nieau la qui serait le déterminant des gènes actifs par un émcanisme proche de celui de l’inactivation du chromosome X. La deuxième hypothèse concerne l’interdépendance de la barrière de cohésin avec la présence d’UBF. Découverte d’une méthode de normalisation en ChIPseq efficace pour les séquences répétées de l’ADN Points de contrôles potentiels d’UBF le long du gène RPI au Spacer promoteur bloqué en élongation par TTF appuie des résultats récents portant sur l’etat d’activation des gènes ribosomaux Zone d’exclusion des nucléosomes grâce à des protéines d’architectures UBF non homogène RPI bloquée en élongation dans la zone du Spacer Promoteur (sans TIF-IA) TTF en aval de la polymérase dans cette zone Barrière anti-nucléosomale (cohésines)

10 QUESTIONS?