Préparation des échantillons :

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1 Préparation des échantillons :
Dosage simultané de 15 produits stupéfiants dans les cheveux avec extraction en ligne H. GRISON-HERNANDO1, C. RENAUD1, G. DESLANDES1, A. PINEAU1, E. DAILLY1, P. JOLLIET1, C. MONTEIL-GANIERE1 1Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU de Nantes  Objectifs : Mise au point et validation d’une méthode de dosage simultané de 15 produits stupéfiants dans les cheveux Validation selon les exigences du Cofrac (document SH GTA 04) Système chromatographique : Analytes et EI : transitions et paramètres composé-dépendants Molécule, EI deutéré ion parent (m/z) ion fils (m/z) DP (V) EP (V) CEP (V) CE (V) CXP (V) Opiacés 6-MAM 328.2 165.1 56 5.5 22 45 4 211.2 31 D3-6-MAM 331.1 10 53 Morphine 286.1 152.2 20.029 73 165.2 47 D3-Morphine 289 40 20.152 50 Codéine 300.2 20.625 61 215.2 34 D3-Codéine 303 20.744 35 Dihydrocodéine 302.2 199.2 43 20.71 46 171.2 57 D6-Dihydrocodéine 308.1 202.2 Ethylmorphine 314.1 66 21.213 89 115.1 101 Cocaïniques Cocaïne 304.2 182.2 20.795 25 105.1 41 D3-Cocaïne 307 185.2 20.913 20 Benzoylecgonine 290.1 168.2 20.198 39 D3-Benzoylecgonine 293 20.321 Cocaéthylène 318 196.2 6 82.1 D3 Cocaéthylène 321.1 199.3 36 4.5 21.509 colonne SPE Stata-X (Phenomenex) 25 µm, 20x2 mm Molécule, EI deutéré ion parent (m/z) ion fils (m/z) DP (V) EP (V) CEP (V) CE (V) CXP (V) Amphétamines Amphétamine 136.1 91 24 10 13.686 25 4 65 50 D5-Amphétamine 141 93.1 40 13.893 20 Métamphétamine 150.1 14.278 27 D5-Métamphétamine 155 92.1 14.485 MDMA 194.1 163.1 31 16.139 17 105.1 34 D5-MDMA 199.1 165.1 16 MDA 180.1 21 4.5 14 135 23 D5-MDA 185.1 110.1 88 15.758 30 MDEA 208.1 26 33 163.2 D5-MDEA 213.1 76 16.942 MBDB 208 77 57 51 79 D5-MBDB Cathinone Méphédrone 178.1 160.2 15.462 15 144.2 35 D3-Méphédrone 181.1 148.1 15.589 A : chargement de la colonne d’extraction colonne analytique Kinetex (Phenomenex) PFP 2,6 µm, 100x3 mm Strata-X® Kinetex®(60°C) pompe 2 pompe 1 HPLC Agilent 1260 API 3200 QTrap® ESI mode positif sMRM deux transitions par composé Injecteur Poubelle Poubelle HPLC Agilent 1200 B : élution sur la colonne analytique Strata-X® Kinetex® (60°C) pompe 2 pompe 1 Injecteur Poubelle Poubelle Préparation des échantillons : Décontamination : 2 x 2 min H2O puis 2 x 1 min DCM Séchage puis découpe des cheveux ( 1 mm) Pesée : 50 mg Incubation : ajout EI deutérés : 25 µL + 2 mL de MeOH → incubation une nuit à 40°C avec agitation Concentration : évaporation du MeOH Reprise de l’extrait sec : 100 µL phase A/MeOH (70/30) Centrifugation Injection : 20 µL Gradient et phases mobiles : Pompe1 : tampon formiate d’ammonium 2 mM Position de la vanne A B A - voie A: formiate d’ammonium 2 mM dans H2O, 0,2% acide formique - voie B: formiate d’ammonium 2 mM dans acétonitrile-méthanol 30-70, 0,2% acide formique Pompe 2 Run : 15 min Préparation de la gamme et des contrôles de qualité : Cheveux vierges (volontaires) Décontamination, découpe Surcharge avec des solutions méthanoliques contenant tous les composés → gamme de 0,05 à 10 ng/mL → contrôles de qualité : 0,2 et 2,0 ng/mg Résultats Linéarité : r > 0,998 Répétabilité (n=5) Reproductibilité (5 jours) Limite de quantification : 0,05 ng/mg Rendement de l’étape d’incubation dans le méthanol : de 57 à 69 % Stabilité : 72 h dans le godet d’injection Contamination inter-échantillon : absence Effets matrice : surcharge de 5 cheveux vierges différents et calcul du CV < 15 % => pas d’effet matrice, sauf pour MDA et MDEA sur 3 niveaux de contrôle (0, ,75 - 7,5 ng/mg) CV <15%, exactitude > 85% Conclusion : Méthode de dosage de 15 produits stupéfiants dans les cheveux validée (sauf MDA et MDEA) L’extraction en ligne permet de simplifier la préparation des échantillons avant injection dans le système chromatographique => simple incubation dans du méthanol Contrôle de qualité interne externalisé pour 9 composés (amphétamine, métamphétamine, MDMA, MDA, MDEA, cocaïne, BEG, morphine, 6-MAM) résultats très satisfaisants Utilisation en routine pour rechercher une consommation de produits stupéfiants à distance de la prise chez le vivant ou en post-mortem 23ème congrès de la SFTA – 53ème congrès de la STC – Arcachon – 2 au 5 juin 2015