Université Alger 1 Ben Yousef Ben khedda Faculté des sciences département SNV L3 biochimie Module ICM Td n°2: test d’immunoélèctrophorèse Présenté.

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1 Université Alger 1 Ben Yousef Ben khedda Faculté des sciences département SNV L3 biochimie Module ICM 29.10.2017 Td n°2: test d’immunoélèctrophorèse Présenté par : Deffous Djihane Chikh Lyssia Diah Yasmine

2 sommaire IntroductionDéfinitionBut Matériels Méthodes et résultats Principe du testélectrosynérèseconclusion

3 1.INTRODUCTION Les techniques développées en immunologie sont en général basées sur la réaction entre un Ag et son Ac spécifique. Parmi les techniques qui démontre cette interaction on a les réactions d’immunoprécipitation qui permettent de visualiser a l’œil nu ou a l’aide d’un appareillage d’observation le couple Ac-Ag qui forme un réseau tridimensionnel en milieu liquide ou en milieu solide.

4 Tests d’immunoprecipitation Milieu liquide Test de l’anneau Méthode d’heidel berger et kendall Milieu solide Immunodiffusion simple Méthode d’oudin méthode de mancini Immunodiffusion double Méthode d’ouchterlony électrophorèse electroimmunodiffusion électrosynerèse Immunoelectrophorese de grabar et williams

5 2.DEFINITION Technique d'analyse qualitative inventée par Grabar et Williams, elle met en jeu une séparation électro- phorétique des protéines dans un gel d'agarose, suivie d'une diffusion double selon une direction perpendiculaire à l'axe de migration. Chaque zone d'équivalence correspond à un précipité qui se traduit par un arc de précipitation Ac-Ag. Ou en plus simple L’immunoélectrophorèse est une méthode de fractionnement et séparation des protéines par migration dans un champ électrique (électrophorèse) et la précipitation de ces protéines à l’aide d’immun sérums (immunodiffusion)

6 3.BUT DU TEST séparer et identifier les principaux constituants protéiques d’un liquide un bio sérum le plus souvent mais aussi les urines. Dans le domaine bio médical elle met en évidence les phénomènes inflammatoires (recherche de certaines maladies)

7 4.MATERIELS Sérum humain Les globulines sériques ont été nommées par Tiselius en 1950 d'après leur vitesse de migration électrophorétique par rapport à l'albumine qui migre le plus rapidement et présente la concentration la plus élevée. On distingue ainsi les alpha (1 et 2), bêta (1 et 2) et gamma globulines dans l'ordre des vitesses Gels d'agarose L'agarose est une forme purifiée de l'agar non chargé La concentration habituellement employée dans les techniques immunochimiques est de l'ordre de 1% ce qui permet la diffusion des protéines

8 Appareil électroohrese Une cuve pour électrophorèse clinique est formée de deux réservoirs de tampon séparés munis chacun d'une électrode de platine. Chaque support de gel est placé à cheval au dessus de la cloison qui sépare les deux réservoirs. Immun sérum contenant des ag anti sérum humain Coloration des gels Pour visualiser les arcs de précipitation. S'ils sont très intenses, ils sont un peu visibles comme des lignes blanchâtres dans le gel sinon Pour faciliter leur mise en évidence, on les colore avec du le bleu de Coomassie la fixation du gel et sa coloration puis une décoloration du fond. Une fois séchés, les gels peuvent être conservés indéfiniment

9  L’’immunoelectrophorèse Méthode de référence, cette technique a été mise au point par Grabar et Williams dans les années 50 elle utilise 2 grands principes : 1.le pouvoir de résolution de l'électrophorèse 2. la grande spécificité des réactions immunochimiques. Elle permet ainsi des analyses qualitatives extrêmement fines. l'immunoélectrophorèse, ne peut être considérée comme quantitative et reste une méthode d'analyse essentiellement qualitative ou semi quantitative.

10 1.L’électrophorèse C’est une technique biologique utilisée pour séparer et caractériser des molécules basée sur le fait que dans un milieu donné soumis à un champ électrique la migration et la séparation des molécules ce fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identique en fonction de leur taille et de leur forme La séparation et l'identification de protéines par électrophorèse de liquides biologiques est utilisée en immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire

11 Dans un premier temps, le mélange d'Ac mis dans un réservoir dans le gel d'agarose ou de gélose après dépôt de la solution à analyser dans un puits; est soumis à un champ électrique permettant une séparation électrophorétique.

12 Dépôt des échantillons Le gel est alors mis en place dans la cuve et le contact électrique entre le tampon placé dans les deux réservoirs et le gel est assuré par des bandes de papier filtre trempées dans le tampon. Après fermeture du couvercle et mise en marche de l'alimentation, la migration des protéines démarre. La tension appliquée au gel et le temps de migration dépendent de la nature des échantillons à analyser.

13 Fixation et coloration Une fois la migration électro phorétique terminée, le gel est plongé pendant dix minutes dans le fixateur, séché puis plongé pendant 10 minutes dans le colorant. Une succession de bains dans la solution de décoloration permet ensuite d'éliminer la coloration du fond de façon à faire apparaître les bandes correspondant aux diverses protéines séparées.

14 les protéines sont séparées selon leur charge, et se répartissent selon le profil électro phorétique habituel, des plus négatives au plus positives : albumine, a1, a2, b et g globulines.

15 2. Immunodiffusion double Ce deuxième temps est immunologique. À la fin de la migration une rigole transversale est creusée dans la gélose dans un plan perpendiculaire à l'axe de migration électro phorétique. et un antisérum y est déposé(double diffusion ). Aux zones d'équivalence respectives il se forme autant d'arcs de précipitation qu'il y a de systèmes Antigène-anticorps Lorsque s'est dessinée la figure de diffusion, on peut ajouter des colorants qui facilitent la caractérisation des diverses protéines formant les arcs de précipité

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19 Interprétation des témoins : L’interprétation de l’immunoélectrophorèse se fait en comparant les arcs de l’échantillon aux arcs du SHN (témoin normal). Cette comparaison se fait sur 3 critères : 1.déformation des arcs 2.apparence de l’arc (longueur, épaisseur et densité) 3. distance par rapport à la gouttière

20 remarque Cette méthode est aujourd'hui moins utilisée car elle a comme principaux inconvénients : 1.d'avoir un délai de réponse long de par sa méthodologie (au moins trois jours), 2.d'être difficilement automatisable et de 3.nécessiter une grande expertise pour sa réalisation et son interprétation 4.elle est soumise aux causes d'erreur des techniques de précipitation (excès d'antigène, etc) On opte alors pour l'immunofixation variante méthodologique de l'immunoélectrophorèse, qui a l'avantage d'être plus rapide. Leur première étape est identique; La deuxième étape, proprement immunologique, diffère, puisque l'anticorps spécifique est déposé à la surface du gel dans lequel il va pénétrer. Un précipité va se forme s'il y rencontre son antigène. Les complexes antigène anticorps sont piégés directement dans le gel, ce qui élimine certains inconvénients de l'immunodiffusion ; c'est là la principale différence avec l’immunoélectrophorèse.

21 Electrosynerese (Immunoelectrophorese inversée ) C’est une technique qui permet de rechercher par diffusion en milieu gélose la présence d’un antigène au moyen d’un anticorps de spécificité connue la diffusion étant accélérée par un champ électrique les Ag et les Ac sont placés l’un en face de l’autre dans les puits de le gélose qui est ensuite reliées aux électrodes l’Ac est placé du coté de la cathode l’ag est placé du cote de l’anode ils migrent l’un vers l’autre et a leur point de rencontre(équivalence) il apparait un arc de précipitation

22 Conclusion l'immuno-électrophorèse est une méthode d’immunoprecipitation (une précipitation immuno-chimique) combinait a une électrophorèse en milieu gélifié. La rencontre des antigènes et des anticorps, après diffusion, met en évidence un certain nombre de lignes de précipitation (complexe ac ag) c’est une technique simple qui ne nécessite qu’un appairellageage beaucoup moins couteuse que les autres techniques qui permet ainsi des analyses qualitative la méthode est donc sensible elle est un peu plus longues puisque elle rend des diagnostique en moins de 24 h