AIDE DU LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE POUR LA PRESCRIPTION DES ANTIBIOTIQUES N.Frebourg CHU de ROUEN.

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1 AIDE DU LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE POUR LA PRESCRIPTION DES ANTIBIOTIQUES
N.Frebourg CHU de ROUEN

2 48 – 72 h LES ENJEUX DE L’ANTIBIOTHERAPIE EMPIRIQUE
Prise en charge du patient Résultats bactériologiques Prélèvements Après la prise en charge d’un patient suspect d’être infecté il y a une période de 48 –72 heures qui précède les résultats bactério et pendant laquelle le traitement AB ne peut être qu’empirique Antibiothérapie probabiliste Modification éventuelle de l’antibiothérapie 48 – 72 h

3 Notion de spectre d’un antibiotique
 Habituellement Sensible Peut inclure des bactéries dont le % de résistance s ’étend de 30 à 70 % ! Infections peu sévères  ttt empirique Infections graves  Antibiogramme  Modérément Sensible Catégorie Intermédiaire Infections peu sévères  ttt empirique  Résistante Résistance naturelle Résistance acquise de prévalence très élevée Pour maîtriser cette antibiothérapie empirique il faut connaître le spectre des AB. Dans le Vidal les bactéries sont catégorisées en 3 classes Les pneumocoques par exemple sont svt SDBL donc inconstamment S et pourtant classés dans la catégorie 1 L’ancienne classification comportait une classe « inconstamment sensible », certainement plus explicite

4 Exemple de l’amoxicilline
ESPECES SENSIBLES : - Aérobies à Gram + : Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes, Nocardia asteroïdes, streptococcus, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae ( %). - Aérobies à Gram - : Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bordetella pertussis, capnocytophaga, eikenella, Escherichia coli ( %), …………………… Avant l’harmonisation européenne : catégorie INCONSTAMMENT SENSIBLE

5 LES RAISONS DE L’ECHEC Solutions AB inefficace sur les bactéries en cause Emergence d’une bactérie résistante Concentration insuffisante dans le foyer Temps de contact insuffisant - Pic trop faible Adaptation aux germes Adaptation à l’ATB Augmentation de la dose Changement de molécule Association Reprise chirurgicale Dosage AB Changement de mode d’administration

6  Optimisation du prélèvement Antibiothérapie empirique
ROLE DU BACTERIOLOGISTE  Optimisation du prélèvement Antibiothérapie empirique Ecologie bactérienne, fréquence des résistances acquises Adaptation de l’antibiothérapie Diagnostic bactériologique Antibiogramme et son interprétation CMI, associations, dosages… Maîtrise des épidémies Dépistage des bactéries multirésistantes Mise en évidence des phénomènes épidémiques - le bactério a pour devoir de connaître et de vous faire connaître les caractéristiques écologiques de votre hôpital et de votre service, qui vont bien sûr influencer votre antibiothérapie empirique le bactério a un rôle central dans la documentation de l’infection

7 Le prélèvement - Avant toute antibiothérapie
- Site bien choisi  le moins contaminé possible - Mode de prélèvement Milieux de transport Prélèvements multiples - Délai d’acheminement La qualité du prélèvement est un pré-requis essentiel à une bonne analyse bactériologique. sur cicatrice op: plutôt seringue en profondeur qu’un écouvillon en surface Plutôt liquide de drain que le drain lui-même Portagerm très conseillés pour plvts précieux + INFORMER LE LABO (endocardites, sepsis de prothèses …)

8 Modes de prélèvement Prélèvement liquide Prélèvement très peu abondant
(risque de retard diagnostique pour les prélèvements polymicrobiens) Prélèvement très peu abondant Prélèvement solide (pour examen direct)

9 Les hémocultures 1 heure
1 série par jour suffit = ae + anae puis ae 1 heure plus tard Par ponction veineuse Infections sur KT: prélever par le KT et acheminer immédiatement ++ Eviter d’ensemencer des prélèvements polymicrobiens sur ces fioles: perte de 24 h pour isoler les germes

10 Les hémocultures systèmes automatisés détection précoce
délai habituel = 5 jours hémocultures avec délai de positivité détection du CO2 bactérien par spectrométrie infrarouge ou virage d’un indicateur coloré (montrer fiole) Faux + si fiole trop pleine (CO2 cellulaire)

11 Un laboratoire ouvert 24h/24
- LCR - Liquides péritonéaux et pleuraux PBDP, Brosses, PTT, AET (de Réanimation) Valves d’endocardites - Liquides articulaires - Liquides amniotiques et « périphériques » - Liquides de vitré, humeur aqueuse Hémocultures quantitatives … et tout prélèvement demandé et justifié ... - Liste non exhaustive: p.ex. abcès cérébral, abcès hépatique sont aussi traités en urgence - Sur appel tel.: urine de pyélonéphrite (+ ed à demander au besoin)

12 Délai d’acheminement des prélèvements
Prélèvements sans milieu de conservation (PL ++, pvts respiratoires..) Hémocultures avec délai de positivité ECBU Hémocultures standards

13 Le travail « extemporané »
 Examen direct - faisabilité - sensibilité - spécificité - valeur pronostique non faisable sur hémocultures ni sur prélèvements solides (os ..) - Rapide = 30 min Positif = correspond à 105 germes par ml Spécificité variable: pièges quand AB PHOTO = pneumo dans LCR

14 Les pièges de l’examen direct
Entérocoques sans AB – avec AB (bacillaire)

15 Le travail « extemporané »
 Cytologie (quantitative ou qualitative)  Antigènes solubles - sang, LCR méningites - urines légionelles, pneumocoque Cyto: réaction leucocytaire = critère diagnostique d’infection - quantitative pour liquides séreux (LCR, LPL, Lart, U…) - qualitative pour autres (LPT…) Ag solubles: peu sensibles mais intérêt dans inf décapitées – PNEUMO sur arguments car coût ++ attention Ag urinaire de légionnelle ne détecte pas tous les groupes

16 Délai habituel des cultures
h staph., strepto, entérob., pseudom. 2 - 5 j anaérobies 3 -6 sem mycobactéries, Brucella, Bartonella  Conservation des ensemencements Suppurations  48 h (anaé : 5 jours) Urines  24 h (48h) Liqu. articulaires  7 j (Brucella : 21 j) Abcès cérébral  15 j Inf. sur prothèse  15 j Cornée, vitré  15 j Dès 1er jour de culture orientation et réponses partielles à l’ordinateur

17 La recherche des anaérobies
Milieux de transport adaptés Non systématique Plus longue que la recherche des aérobies Eviter les écouvillons ordinaires: il existe des écouvillons spécifiques mais peu utilisés Recherche systématique sur tous les abcès/suppurations mais pas dans les plvts pulmonaires p. ex. Délai = 5 jours => maintenir la couverture antianaérobie jusqu’à ce délai

18 Suivi d’une culture : la 24ème heure
Caractère mono/polymicrob. Orientation d’identification milieux chromogènes tests simples Quantification éventuelle Mise en œuvre de l’ABG Milieu chromogène permet de reconnaître plus vite certains germes Tests diagnostiques simples à partir des colonies: oxydase des pyo PHOTO = coli (CR) + enc (CV) Réponses partielles Ex . Liquide péritonéal

19 Antibiogramme direct (liquides péritonéaux)
ATB direct E.coli Pénicillinase R AMC S TZP E.faecalis S AMX

20 (liquides péritonéaux)
Antibiogramme direct (liquides péritonéaux) AMC CTX E.coli Pénicillinase E.faecalis S AMX TZP ETP ETP TZP E.coli Pse E.cloacae Cse dérépr. Entérococcus S AMX CTX ETP CTX AMC

21 Antibiogramme direct (urines)
SXT ETP OFX AMC FOS CTX FT

22 L’antibiogramme : une constante ?
 Nature du prélèvement Caractère mono ou polymicrobien Pathogénicité des germes  Seuil de positivité des cultures quantitatives PBDP, Brosse  103 LBA  105 AET  KT  103 ECBU  104 LA  104 - a priori pas d’ABG sur les germes contaminants: SE, bacillus.. Sauf cas particulier (NN) quand polymicrobien s’assurer que le labo fait bien les ABG souhaités, p.ex. l’enc dans les LPT Fiabilité des cult quantitatives => respecter les protocoles de prélèvement = 6 cm de KT, PBDP dirigé

23 L’antibiogramme : une constante ?
Brosse protégée  Streptocoque 102  Levures 5.102  Entérobactérie < 102 CB = strepto et levures Grosses CJ = enb Pas d’antibiogramme

24 PBDP Brosse protégée  S.aureus 102 ABG à discuter
 Entérobactérie 105  Pneumocoque 104 ABG systématique

25 Délai de résultat de l ’antibiogramme
Technique classique : h Automatisé : h

26 Allongement du délai de l’antibiogramme
 Colonies non isolées (cultures polymicrobiennes)

27 Allongement du délai de l’antibiogramme
 Polyclonalité Double population de S.epidermidis

28 Allongement du délai de l’antibiogramme
Tests supplémentaires - Résistance à la méticilline ? antibiogramme (24h) tests rapides de confirmation Ac monoclonal (30’) PCR mecA (2h) - Sensibilités diminuées CMI La recherche du gène lmecA peut être faite d’emblée et répondue dans la journée => gain de temps ++

29 Diagnostic moléculaire en bactériologie
 A partir de prélèvements  bactéries peu cultivables Méningites décapitées Coqueluche Tuberculose Rickettsies, bartonella autres…. PCR spécifique ou universelle A partir de cultures  bactéries difficiles à identifier PCR « universelle »  Séquençage Quand la culture est négative on peut faire appel aux techniques de BM

30 Diagnostic moléculaire des infections bactériennes
BLAST PCR Identification au rang de genre ou d’espèce Chromosome bactérien Lorsque l’on fait une PCR dite universelle des bactéries, le plus souvent de l’ADN codant pour la sous unité 16S des ribosomes, il faut ensuite séquencer ce fragment d’ADN amplifié (à l’aide d’un séquenceur automatique), puis aller voir dans les banques de données disponibles sur Internet (genbank) à quelle espèce bactérienne correspond la séquence que l’on a obtenue.

31 La biologie moléculaire complète la bactériologie conventionnelle,
Diagnostic moléculaire des infections Limites - inhibiteurs de la PCR - pas d’antibiogramme La biologie moléculaire complète la bactériologie conventionnelle, elle ne la remplace pas.

32 PCR et résistance aux antibiotiques
Résistance Gène Staphylocoques méticilline mecA Entérocoques glycopeptides vanA, vanB.. M.tuberculosis rifampicine rpoB

33 Déroulement de l ’analyse bactériologique
Produit pathologique J1 J1 30 ’  Cyto - ED J2 Culture PCR spécif PCR 16S polymicrobienne pure Isolement Identification Antibiogramme J3 J4 Identification Antibiogramme Séquençage J5

34 Antibiogramme : le principe
Il explore l’activité bactériostatique de l’antibiotique - paramètre le plus fiable - le plus aisément quantifiable - bonne correlation bioclinique

35 106 bactéries/ml 0,25 0,50 1 2 4 8 mg/l 10% <0,01%
0,25 0,50 1 2 4 8 mg/l Cette diapo a pour objet de vous rappeler la notion de CMI Si on ensemence un inoc bactérien en présence de cc croissantes d’AB on observe qu’à partir d’une certaine cc d’AB il n’y a plus de croissance visible dans le tube = CMI = correspond à la bactériostase = déterminée par l’ABG Mais il y a des survivants et il faut une CMB pour être réellement bactéricide. Cte CMB n’est pas déterminée en pratique courante 10% <0,01%

36 Interprétation de l’antibiogramme
c C CC CMI Sensible Intermédiaire Résistant  Concentrations critiques - étude de populations bactériennes - possibilités d’emploi thérapeutique  Adéquation CMI / réponse clinique Quand on fait un ABG on ne répond pas une CMI mais une catégorisation en SIR, grâce aux recommandations du CASFM qui a déterminé pour chaque AB des concentrations critiques. Les CC sont établies en étudiant des populations bactériennes et en tenant compte des poss. d’emploi (doses toxiques) Quand la CMI (calculée à partir du diamètre d’inhibition) est < à la cci la souches est S

37 Lecture interprétative de l’antibiogramme
• Principe Déduction du mécanisme de résistance Correction des résultats Limiter les échecs thérapeutiques Les données biocliniques sont validées par le CA SFM • Réalisation Règles d’interprétation Lecture individuelle ou par un système expert

38 Interprétation de l’antibiogramme L’exemple des staphylocoques
Le biologiste doit savoir interpréter l’ATB ! Le clinicien aussi… Staphylocoque et bétalactamines Pénicilline G R Oxacilline S Amoxicilline ? Augmentin ? Cefotaxime ? Imipénème ?…..

39 Interprétation de l’antibiogramme L’exemple des staphylocoques
 Résistance à la méticilline- Interprêter l’ABG c’est aussi appliquer certaines règles en connaissant les mécanismes de Rce des bactéries Par ex pour les staph Vous aussi vous faîtes de l’interprétation d’ABG En effet on vous teste seulement 2 moléc de BL: la péniG et l’oxacilline Qd le staph est R à la péniG seulement = Pse => R amox, ticar, pipera => S ibla (AMC) Qd le staph est R à l’oxa = metiR => R à toutes les BL même les plus actives comme l’imipénème

40 une grandeur phénoménologique, pas une constante biologique
La C.M.I. une grandeur phénoménologique, pas une constante biologique Soumise aux aléas  de l’inoculum  du temps de contact avec l’antibiotique  des conditions expérimentales Malgré sa bonne corrélation avec la réponse clinique l’ABG présente des limites liées au fait que la CMI est grandeur phénoménologique et pas une constante Ainsi les résultats peuvent varier selon les conditions expérimentales

41 Effet inoculum

42 CMI : quand et comment - Systématique Pneumocoques SDBL et béta-lactamines A demander Staphylocoques et glycopeptides Situations difficiles (endocardites…) Echecs, multirésistance, germes rares.. Quand on fait l’ABG standard on ne peut pas répondre un chiffre de CMI, la méthode des disques n’est pas assez précise. Parfois on a besoin d’une CMI précise: p. ex. dans les infections très sévères où on veut contrôler le taux sérique d’AB ou pour certaines bactéries envers certains AB: Pneumos SDBL, staph et GP (teicoplanine en partic pour les SCN) - Principe du E-test

43 Surveillance du traitement antibiotique
Labo de bactério CMI Labo de pharmaco Dosages AB L’évolution clinique est le critère essentiel. QI = cc plasmatique ou tissulaire / CMI PBS = déterminer la dilution maximale du sérum permettant d’obtenir la bactériostase ou la bactéricidie Optimiser la Concentration QI (pic/CMI) > 8 Maximiser le T > CMI AB temps dépendants AB Cc dépendants

44 Surveillance du traitement antibiotique
 Associations d’antibiotiques  Intérêt des associations - élargir le spectre ++ - être synergique (1 + 1 = 3) - diminuer le risque de sélection de mutants R ?  Recherche de la synergie au laboratoire - Méthodes de référence (échiquier) - Méthodes rapides - disques d’antibiotiques - bandelettes (E-test)

45 E-test et recherche de synergie
CMI cipro : > 32 mg/L (Résistant) CMI ceftaz : 64 mg/L CMI cipro + ceftaz : 0.75 mg/L (Sensible) Après contact 1h avec la 1ère bandelette on dépose la seconde en superposant les concentrations équivalentes

46 Surveillance du traitement antibiotique
 Associations d’antibiotiques  Fractional Inhibitory Concentration (FIC) CMI de A en prés. de B CMI de B en prés. de A CMI de A CMI de B  0,5  Synergie > 0,  Addition > 1 < 2  Indifférence  2  Antagonisme

47 La CMB Paramètres non évalués par l’antibiogramme CMB /CMI 1 – 2
Non déterminée en pratique courante CMB /CMI 1 – 2 CMB /CMI 4 – 16 CMB /CMI > 32 Antibiotique bactéricide Antibiotique bactériostatique Tolérance Tétracyclines Macrolides Lincosamides Acide fucidique Furanes Phenicoles Béta-lactamines Aminosides Quinolones Vancomycine Fosfomycine Rifampicine Métronidazole Bétalactamines Et Streptocoques Vancomycine Et Pneumocoque

48 Paramètres non évalués par l’antibiogramme
 Phénomène de la tolérance CMB / CMI  32  Caractère Cc-dépendant ou Tps-dépendant de l ’AB  Effet post-antibiotique tolérance des strepto envers les BL, de certains pneumos envers la vanco due à des mutations des systèmes d’autolysines l’ATB ne prend bien sûr pas en compte le mode et le rythme d’administration Effet post-AB: persistance du stress bactérien induit par l’AB (notamment avec les aminosides): permet en théorie d’espacer les doses

49 Bactériologiste et maîtrise des épidémies
- Connaître l’écologie bactérienne d’un service Identifier une épidémie - Détecter le portage de bactéries multirésistantes p.ex. qd bactéries du groupe KES on sait que le taux de CD est élevé => on presrit d’emblée une C4G pour P. ex. par d’IPM sur pyo

50 Surveillance de la colonisation par les BMR
Réanimation Recherche de SARM Ecouvillon nasal + axillaire À l’entrée Hebdomadaire Recherche de BLSE et d’acinetobacter Ecouvillon rectal Maintenir l’isolement pendant tout le séjour en Réa Autres services Ecouvillon hebdomadaire Patients connus Détection de BMR dans site infecté Lever l’isolement après 2 écouvillons négatifs

51 CONCLUSIONS COMMUNIQUER … pour - choisir les analyses - transmettre les résultats - optimiser le traitement - connaître l’écologie