APOPTOSE.

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1 APOPTOSE

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7 Cellule Normale Cellules en apoptose

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10 Qu’est ce qu’une caspase? (les exécuteurs )
Les caspases sont nécessaires et suffisantes pour induire l’apoptose

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13 La direction ou non vers l’apoptose dans une cellule, est définie par le ratio entre les protéines pro-apoptotiques (comme Bax) et anti- apoptotiques (comme Bcl2). Bcl2 et Bax se lient entre elles et se neutralisent. Un excès de Bcl2 détermine la survie cellulaire et un excès de Bax détermine la mort cellulaire ou apoptose. L’excès de Bcl2 empêche la sortie du cytochrome C de la mitochondrie, cela pousse l’équilibre vers la survie cellulaire et donc vers un échappement de l’apoptose.

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15 Techniques d’étude de l’apoptose
1- Mise en évidence de la condensation et de la fragmentation de l'ADN chromosomique lors de phénomènes de mort cellulaire C’est une technique de coloration des noyaux des cellules par un fluorochrome présentant une affinité pour l’ADN : le DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride).

16 méthode d’étude des cellules apoptotiques
Mesure de la quantité d’ADN Le noyau de la cellule apoptotique se divise en fragments de noyau qui sont au sein de vésicules membranaires (les corps apoptotiques) qui ont une quantité d’ADN inférieure à 2n.On peut ainsi compter le nombre de vésicules et mesurer la concentration d’Adn ds chaque vésicule.  Si dans un tissu on retrouve des quantités d’ADN inférieures à 2n cela signifie qu’il y a des cellules en cours d’apoptose (attention aux gamètes qui ont une quantité d’ADN égale à n) mesure de la quantité d’ADN : iodure de propidium fixation des cellules perméabilisation membranaire

17 incubation en présence d’iodure de propidium (composé fluorescent qui s’intercale entre les bases de l’ADN) la fluorescence mesurée est proportionnelle à la quantité d’ADN

18 Evaluation de l'apoptose par le marquage in situ des extrémités 3' libres de l'ADN nucléaire : méthode TUNEL Ce marquage permet de mettre en évidence in situ la fragmentation de l'ADN nucléaire résultant de l'activation des endonucléases au cours de l'apoptose. Cette méthode est basée sur le marquage des extrémités 3'-OH libres de l'ADN par la terminal transférase (tdt) : cette enzyme catalyse l'accrochage de nucléotides marqués à la fluorescéine au niveau des extrémités 3'-OH libres (à ce stade, le marquage peut être examiné au microscope à fluorescence). La fluorescéine est ensuite détectée par un anticorps anti- fluorescéine couplé à la peroxydase. Le marquage est révélé en utilisant la diaminobenzidine (0,05 % dans du PBS) comme chromogène. Après contre coloration au bleu de toluidine et montage des lamelles, les cultures sont examinées au microscope optique. Les cellules apoptotiques sont caractérisées par un marquage nucléaire brun et les cellules non apoptotiques par l'absence de marquage brun (Figure 5). Un témoin négatif est réalisé au cours de chaque expérimentation : sur une lamelle, la réaction est effectuée en remplaçant l'enzyme tdt par de l'eau distillée. Aucun marquage ne doit être détecté.

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20 Figure 5 : marquage des cellules apoptotiques par la méthode de TUNEL

21 Fragmentation de l’ADN
La fragmentation de l'ADN est causée par les endonucléases induites durant le processus apoptotique. La coupure de l'ADN se produit préférentiellement dans une région spécifique de l'ADN, ce qui provoque la libération de fragments oligonucléosomaux typiques de l'apoptose de paires de bases. Ces fragments peuvent être visualisés sur un gel d'agarose sous forme de bandes multiples formant une "échelle d'ADN" (DNA ladder) (figure 6).

22 Dans la ligne 1, on retrouve un marqueur de poids moléculaire; dans la ligne 2, on retrouve des cellules U937 sans stimulus apoptotique; dans la ligne 3 des cellules U937 avec un stimulus apoptotique et dans la ligne 4 on retrouve un contrôle positif.

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24 Activation des protéases
L'identification des protéines présentes dans une préparation cellulaire ou tissulaire selon leur poids moléculaire peut se faire à l'aide d'une technique appelée "western blot » Analyse par "western blot" du précurseur de caspase-3 dans des "lysats" de cellules de : A) Jurkat, B) HUT 78, C) CCRF-HSB-2.

25 Test d'affinité à l'annexine V
Couplée à un marqueur fluorescent, l'annexine V permet de détecter les cellules en premières et mi-phases d'apoptose. En effet, l'un des premiers évènements de l'entrée en apoptose d'une cellule est l'exposition de la PS (la phosphatidylsérine) au milieu extracellulaire. Dans des conditions normales, ce phospholipide présent dans la membrane plasmique est exposé qu'au milieu intracellulaire, mais se retrouvé exposé à l'extérieur durant l'apoptose.

26 Annexine V détecte l'exposition du PS à la surface de la membrane cellulaire. Au cours de l'apoptose précoce, la membrane plasmique perd son asymétrie ce qui permet à la PS d’être transloquée à la face externe. Comme l'apoptose progresse et la membrane plasmique est altérée, PI (Propidium iodide) peut servir comme un marqueur supplémentaire de l'apoptose.

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