Amorces 2 amorces sont requises pour une amplification exponentielle

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1 Amorces 2 amorces sont requises pour une amplification exponentielle
Amorce « Forward » Amorce dont la séquence est la même que celle de la matrice indiquée Amorce « Reverse » Amorce dont la séquence est complémentaire à celle de la matrice indiquée Exemple 3’-GCGGTT••••••••••ATCGTTA-5’ Amorce « Forward »: ATTGCTA Amorce « Reverse »: CGCCAA

2 Rapports de masses et molaires d’ADN
Vous avez un plasmide recombinant de 5 Kpb qui représente un insert de 2 Kpb cloné dans un vecteur de 3 Kpb Combien de µg du plasmide devriez vous digérer pour obtenir 0.5 µg de l’insert? Rapport de plasmide/insert = 5/2 = 2.5 Besoin 2.5 X 0.5 µg = 1.25 µg plasmide pour obtenir 0.5 µg d’insert

3 Rapports de masses et molaires d’ADN
Vous avez un plasmide recombinant de 12 Kpb qui représente un insert de 10 Kpb cloné dans un vecteur de 2 Kpb Combien de µg du plasmide devriez vous digérer pour obtenir 0.5 µg de l’insert?? Rapport de plasmide/insert = 12/10 = 1.2 Besoin de 1.2 X 0.5 µg = 0.6 µg de plasmide pour obtenir 0.5 µg d’insert

4 Rapports de masses et molaires d’ADN
Vous désirez faire une ligature d’un insert de 5 Kpb à 50ng d’un vecteur de 2.5 Kpb Quelle masse d’insert doit être ajoutée à la ligature pour avoir un rapport molaire insert:vecteur de 3:1? Rapport masse: vecteur/insert = 2.5/5 = 0.5 50ng insert : 50ng vecteur = Rapport molaire 0.5:1 50ngX insert : 50ng vecteur = Rapport molaire 0.5X:1 = 3:1 0.5X = 3; 3/0.5 = 6 6 X 50ng =300ng

5 Rapports de masses et molaires d’ADN
Vous désirez faire une ligature d’un insert de 0.5 Kpb à 50ng d’un vecteur de 2.5 Kpb Quelle masse d’insert doit être ajoutée à la ligature pour avoir un rapport molaire insert:vecteur de 3:1? Rapport masse: vecteur/insert = 2.5/0.5 = 5.0 50ng insert : 50ng vecteur = Rapport molaire 5.0:1 50ngX insert : 50ng vecteur = Rapport molaire 5.0X:1 = 3:1 5.0X = 3; 3/5.0 = 0.6 0.6 X 50ng =30ng

6 Misession 14 février Vous devez vous inscrire pour une période d’examen 1-3:30 PM 3:45-6:15 PM Les appareils électroniques ne sont pas permis Portables, tablettes, cellulaires, etc. Les ordinateurs de labo et l’accès à l’internet est permis Toutes formes de communication est interdite L’acitivité sur les réseau sera surveillée

7 Misession Partie I Partie II: Partie III : 8 calculs
Temps: 30 minutes Partie II: 6 exercices de bioinformatique Partie III : 5 questions théoriques Temps: 20 minutes Choix multiples Remplir les blancs Vrai ou faux

8 Misession Partie IV 2 sur 3 problèmes Temps: 45 minutes
Problème 1: 5 questions Analyse de gel Digestions par enzymes de restrictions Cartographie de restriction Problème 2: 5 questions PCR et clonage 8

9 Misession Problème 3: 5 questions Cartographie de restriction
Analyse Southern

10 À savoir Constante de concentration d’ADN Convertir les unités
Amorces forward vs reverse Palindromes Théorie à propos de la bioinfo Vecteurs pUC

11 Exemples de questions Vous avez une solution d'ADN avec une absorbance à 260 nm de 0,15. 0,4 mL de cette solution est ajouté à 0,6 mL d'eau. Quelle est la nouvelle concentration d'ADN en mg/mL? La concentration d'une solution de sel est 0,38% (m/v). 124 mL de cette solution sont placés dans un bécher et permirent de s'évaporer jusqu'à ce qu'il reste que 92 mL. Quelle est la nouvelle concentration de sel? (Présumer que l'eau s'évapore, mais pas le sel.) 67 mL d'une solution de 0,21 g/mL de sucre sont ajoutés à 402 mL de solvant. Quel est le pourcentage (m/v) de sucre dans la nouvelle solution? Quel est le % (v/v) de NaCl dans une solution préparée par la dissolution de 25,5 g de NaCl dans 49 mL d'eau (Densités : eau = 1 g/mL, NaCl= 2 g/mL) Un échantillon de 125 mL d'une solution de ZnCl2 a été dilué avec de l'eau jusqu'à 250 mL. Un échantillon de 50,0 mL de la solution diluée contient 0,05 mole de ZnCl2. Quelle était la concentration de ZnCl2 dans la solution originale non diluée?

12 Tailles des fragments (Kpb)
Exemples de questions Ce tableau indique les tailles des bandes observées après des digestions d'un plasmide. Dessiner une carte possible qui est en accord avec ces résultats. Notez : deux sites de restriction ne peuvent pas occuper la même position et tous les sites de restrictions sont séparés par au moins 0,5 Kpb. Indiquer les position relatives à l’origine; le site EcoRI. Enzymes Tailles des fragments (Kpb) BamHI 9 EcoRI HindIII 2 et 7 PstI 5 et 4 BamHI + EcoRI 4.5 BamHI + HindIII 1.5, 2, et 5.5 BamHI + PstI 1.5, 2.5 et 5 EcoRI + HindIII 1, 2 et 6 EcoRI + PstI 2, 3 et 4 HindIII + PstI 1, 3 et 4

13 Exemples de questions Après une séparation sur un gel d'agarose, un fragment d'ADN de 12 Kpb digéré avec BamHI généra trois bandes dont les distances de migrations correspondu à 7, 3 et 2Kpb. Le même fragment digéré avec EcoRI généra seulement une bande avec une distance de migration correspondante à 6Kpb. Dessiner toutes les cartes de restrictions qui seraient en accord avec le patron de bandes observé. Notez : ne pas inclure des cartes miroirs. Par exemple A-B-C et C-B-A seraient considérées des cartes miroirs et donc les mêmes. Indiquer les positions de chaque site de restriction relativement à l'origine. Étiqueter chacune de vos cartes alpha numériquement (A, B, C, D, etc.)

14 Exemples de questions Compléter les blancs afin de compléter les séquences suivantes pour générer des palindrômes qui représenteraient des sites de restriction potentiels. (Notez que chaque blanc représente un nucléotide unique) 5' GC ___ A___ C 5' GGT ___ ___ ___ 5' ___ CTGC ___ GA 5' GGCT___GC ___ L'enzyme FraII reconnait et clive la séquence C▼NNATNNG. Quelle serait la taille moyenne des fragments après une digestion d’ADN génomique?

15 Exemples de questions Une analyse par enzyme de restriction d'un plasmide recombinant est illustrée ci-dessous. La première voie représente le plasmide recombinant non digéré (UD). Les voies 2-4 représentent le plasmide recombinant digéré avec BamHI, HindIII et PstI. La dernière voie représente le vecteur seul digéré avec HindIII. Les nombres à côté de chaque bande représentent les tailles approximatives en kilopaires de bases. Quelle voie démontre des évidences d'une digestion partielle? Indiquer quelles bandes sont des produits intermédiaires en indiquant leurs tailles.. Combien de sites demeurent à être digérés dans les produits intermédiaires identifiés? Combien de fois est-ce que PstI coupe dans le plasmide recombinant?  Combien de fois est-ce que HindIII coupe dans le fragment BamHI?

16 Exemples de questions Une reaction de PCR est faites pour amplifier une séquence de 500 pb à partir de 10 pg de la matrice simple brin de 100 Kb suivante. Les amorces suivantes ont été utilisées: A: ATGACGAAG et B: ACCATCAGCA Laquelle des deux amorces est l’amorce forward? Combien de cycles serait requis afin d’obtenir un microgramme du produit désiré? 5’ -••••••••••TGGTAGTCGTGC••••••••••GAAGCAGTA ••••••••••-3’ 1 │ 10000 10500 100000

17 Exemples de questions Vous avez une solution d'ADN avec une absorbance à 260 nm de 0,15. 0,4 mL de cette solution est ajouté à 0,6 mL d'eau. Quelle est la nouvelle concentration d'ADN en mg/mL? Rép La concentration d'une solution de sel est 0,38% (m/v). 124 mL de cette solution sont placés dans un bécher et permirent de s'évaporer jusqu'à ce qu'il reste que 92 mL. Quelle est la nouvelle concentration de sel? (Présumer que l'eau s'évapore, mais pas le sel.) Rép. 5.1 mg/mL 67 mL d'une solution de 0,21 g/mL de sucre sont ajoutés à 402 mL de solvant. Quel est le pourcentage (m/v) de sucre dans la nouvelle solution? Rép. 3% Quel est le % (v/v) de NaCl dans une solution préparée par la dissolution de 25,5 g de NaCl dans 49 mL d'eau (Densités : eau = 1 g/mL, NaCl= 2 g/mL) Rép % NaCl Un échantillon de 125 mL d'une solution de ZnCl2 a été dilué avec de l'eau jusqu'à 250 mL. Un échantillon de 50,0 mL de la solution diluée contient 0,05 mole de ZnCl2. Quelle était la concentration de ZnCl2 dans la solution originale non diluée? Rép. 2M

18 Tailles des fragments (Kpb)
Exemples de questions Ce tableau indique les tailles des bandes observées après des digestions d'un plasmide. Dessiner une carte possible qui est en accord avec ces résultats. Notez : deux sites de restriction ne peuvent pas occuper la même position et tous les sites de restrictions sont séparés par au moins 0,5 Kpb. Indiquer les position relatives à l’origine; le site EcoRI. Enzymes Tailles des fragments (Kpb) BamHI 9 EcoRI HindIII 2 et 7 PstI 5 et 4 BamHI + EcoRI 4.5 BamHI + HindIII 1.5, 2, et 5.5 BamHI + PstI 1.5, 2.5 et 5 EcoRI + HindIII 1, 2 et 6 EcoRI + PstI 2, 3 et 4 HindIII + PstI 1, 3 et 4

19 Exemples de questions Après une séparation sur un gel d'agarose, un fragment d'ADN de 12 Kpb digéré avec BamHI généra trois bandes dont les distances de migrations correspondu à 7, 3 et 2Kpb. Le même fragment digéré avec EcoRI généra seulement une bande avec une distance de migration correspondante à 6Kpb. Dessiner toutes les cartes de restrictions qui seraient en accord avec le patron de bandes observé. Notez : ne pas inclure des cartes miroirs. Par exemple A-B-C et C-B-A seraient considérées des cartes miroirs et donc les mêmes. Indiquer les positions de chaque site de restriction relativement à l'origine. Étiqueter chacune de vos cartes alpha numériquement (A, B, C, D, etc.)

20 Exemples de questions Compléter les blancs afin de compléter les séquences suivantes pour générer des palindromes qui représenteraient des sites de restriction potentiels. (Notez que chaque blanc représente un nucléotide unique) 5' GC ___ A___ C GCTAGC 5' GGT ___ ___ ___ GGTACC 5' ___ CTGC ___ GA TCTGCAGA 5' GGCT___GC ___ GGCTAGCC L'enzyme FraII reconnait et clive la séquence C▼NNATNNG. Quelle serait la taille moyenne des fragments après une digestion d’ADN génomique? 4096

21 Exemples de questions Une analyse par enzyme de restriction d'un plasmide recombinant est illustrée ci-dessous. La première voie représente le plasmide recombinant non digéré (UD). Les voies 2-4 représentent le plasmide recombinant digéré avec BamHI, HindIII et PstI. La dernière voie représente le vecteur seul digéré avec HindIII. Les nombres à côté de chaque bande représentent les tailles approximatives en kilopaires de bases. Quelle voie démontre des évidences d'une digestion partielle? Indiquer quelles bandes sont des produits intermédiaires en indiquant leurs tailles. PstI 15, 12, et 5 Combien de sites demeurent à être digérés dans les produits intermédiaires identifiés? 15(2), 12(1) and 5(1) Combien de fois est-ce que PstI coupe dans le plasmide recombinant? 3 fois Combien de fois est-ce que HindIII coupe dans le fragment BamHI? 2 fois

22 Exemples de questions Une reaction de PCR est faites pour amplifier une séquence de 500 pb à partir de 10 pg de la matrice simple brin de 100 Kb suivante. Les amorces suivantes ont été utilisées: A: ATGACGAAG et B: ACCATCAGCA Laquelle des deux amorces est l’amorce forward? ATGACGAAG Combien de cycles serait requis afin d’obtenir un microgramme du produit désiré? Initiale = 0.5/100 X 10pg = 0.05pg de la séquence d’intérêt (simple brin) 3 cycles sont requis afin d’obtenir le produit double brin = 0.1pg 1 X 106pg = 0.1pg(2n) n= 23 3’ -••••••••••TGGTAGTCGTGC••••••••••GAAGCAGTA ••••••••••-5’ 1 │ 10000 10500 100000