LES SONDES Année universitaire 2017/2018 DR. OULDJAOUI AHMED 1.

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1 LES SONDES Année universitaire 2017/2018 DR. OULDJAOUI AHMED 1

2 LES SONDES I – Définition II - Les différents types de sondes
- les sondes ADN génomique - les sondes cDNA - les oligosondes - les ribosondes III- Obtention des sondes - clonage - PCR IV – Marquage des sondes

3 Définition * Sonde : Séquence nucléotidique, généralement marquée, complémentaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN avec laquelle elle va s'hybrider. * Sondes directes : exploration d'un gène ou d'une région génique dont on a déjà quelques informations. * Sondes indirectes ou sondes anonymes : exploration de gènes peu ou pas connus

4 Obtention des sondes AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO : PCR OBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN) OUTILS : - 2 amorces (= oligonucléotides) - ADNpol - Substrats : dXTP PRINCIPE : Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADN à amplifier, on synthétise une très grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles.

5 PRINCIPE 1) DENATURATION : séparation des brins par augmentation de la température (95°C environ) 2) HYBRIDATION des AMORCES avec les bornes de la région à amplifier. (50°C environ) NB : la température doit être diminuée pour que l’hybridation est lieue. 3) SYNTHESE : l’ADNpol synthétise de l’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double la quantité initiale. (70°C environ) Fin du Cycle Après n cycles, on obtient 2n nouveaux exemplaires du fragment d’ADN

6 RESULTATS Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ?
2 copies avec les extrémités 3’ variables. Qu’obtient-on au bout du 2ème cycle ? 8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixes

7 LIMITES et APPLICATIONS
- Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inferieure à 2 kb) - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce) - ADNpol thermorésistante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque d’erreur. Amplification parasite : mauvaise hybridation et contamination APPLICATIONS : - Génération des sondes - Recherche de mutations - RT-PCR : étude des ARN - Clonage - PCR quantitative PCR en temps réel : quantification précise

8 Marquage des sondes 1 - l’agent de marquage : - marquage radioactif
- marquage froid - direct – nucléotide modifié par un fluorophore - indirect – nucléotide marqué par un reporter qui sera repéré par une molécule affine 2 – stratégies de marquage - nick translation - multi-amorçage au hasard - marquage des oligonucléotides

9 Les sondes radioactives
32P, 35S, 3H Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients : 1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des sondes inconfortable 2. décroissance rapide du 32P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment Avantage : grande sensibilité

10 Marquage direct avec un fluorophore
Les sondes froides Marquage direct avec un fluorophore Le nucléotide portant le marqueur est incorporé directement. Groupe chimique qui fluoresce quand il est exposé à une longueur d’onde donnée: Fluorescéine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red, TAMRA, TET.

11 Marquage indirect - digoxigénine - marquage par la biotine-streptavidine.

12 Marquage par Nick-translation
Endonucléase utilisée dans des conditions ménagées La DNAse génère quelques cassures aléatoires simple brin Au niveau des cassures la DNA polymérase I détruit l’ADN par son activité exonucléasique (5’-3’)…. … et le synthétise par son activité polymérase en Présence de nucléotides dont un est marqué

13 Marquage par random priming

14 MARQUAGE D’UN OLIGONUCLEOTIDE

15 • Hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN sur membrane
Différentes Applications • Hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN sur membrane • Sondes oligonucléotides • Séquençage • Hybridation in situ

16 Hybridation après électrophorèse
Southern blot : cible ADN et sonde ADN Hybridation après électrophorèse Southern blot : cible ADN et sonde ADN Northern blot : cible ARN et sonde ADN Western blot : cible protéine (antigène) et sonde protéine (anticorps)

17 Enzymes de Restriction et de modification

18 1. Définition Ce sont des enzymes, principalement d’origine bactérienne, capables de couper l’ADN double brin (et ce quelque soit son origine) à des endroits spécifiques (séquences nucléotidiques) appelés sites de restriction généralement de 4 à 6 paires de bases.

19 2. La coupure ou phénomène de restriction
Le phénomène de restriction a été observé bien avant que les enzymes de restriction ne fussent mises en évidence. En effet, lorsqu’un bactériophage colonise une bactérie, le phénomène de lyse bactérienne, après multiplication du phage par le biais de la machinerie enzymatique de la bactérie hôte peut ne pas avoir lieu. Ceci est expliqué par le fait que : l’ADN phagique est intégré, sous forme silencieuse, dans celui de la bactérie : cycle lysogénique. l’ADN phagique est complètement détruit (hydrolysé) par les enzymes de la bactérie hôte : les enzymes de restriction (Werner Arber).

20 3. Nomenclature des enzymes de restriction
La première lettre, en majuscule, représente l’initiale du genre bactérien. Les deux lettres, minuscules, qui suivent la première sont représentatives de l’espèce. Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numéro d’ordre de découverte de l’enzyme pour la même bactérie source. La dernière lettre majuscule n’est pas obligatoire pour toutes les endonucléases de restriction. Elle est représentative de la souche de la bactérie d’où l’enzyme a été isolée.

21 ENZYMES DE RESTRICTION
A - NOMENCLATURE Escherichia coli Ry13 Eco R I 1ière enzyme trouvée chez E coli Eco R V 5ième enzyme trouvée chez E coli Providencia Stuarti Pst I

22 5 ’……C C C G G G……3 ’ 5 ’ ….C C C G G G…3 ’
B - LES SEQUENCES RECONNUES : palindromiques COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex : EcoR I 5 ’……G A A T T C …….3 ’  ’……. G AATTC……3 ’ 3 ’……C T T A A G …….5 ’  ’……..CTTAA G……5 ’ COUPURES A BOUTS FRANCS ex : Sma I (BLUNT ENDS) 5 ’……C C C G G G……3 ’  ’ ….C C C G G G…3 ’ 3 ’…....G G G C C C……5 ’  ’ ….G G G C C C....5 ’

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24 MspI et HpaII sont appelés des isoschizomers
SITES METHYLES ADN des eucaryotes peut être méthylé au niveau des cytosines CpG. Certaines enzymes ne reconnaissent pas l’ADN méthylé MspI ne coupe pas Hpa II coupe C CG G G GC C C CG G G GC C MspI et HpaII sont appelés des isoschizomers SITES INCLUS Sau 3A site contenu dans Bam HI : sites compatibles …...G A T C…… …...G G A T C C……. …...C T A G…… ……C C T A G G…...

25 Sites = 4 à 6 pbases Coupure fréquente ~ 3kb Sites = 8 pbases
Enzyme Organism from which derived Target sequence (cut at *) 5' -->3' Ava I Anabaena variabilis C * C/T C G A/G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens * G A T C C Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T Eco RI Escherichia coli RY 13 G * A A T T C Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C Mbo I Moraxella bovis * G A T C Pst I Providencia stuartii C T G C A * G Sma I Serratia marcescens C C C * G G G Sst I Streptomyces stanford G A G C T * C Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G Sites = 4 à 6 pbases Coupure fréquente ~ 3kb Sites = 8 pbases Coupure rare ~ kb

26 Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse)
Après coloration au BET

27 Nombre de kb (échelle Log) Migration mm

28 CARTE DE RESTRICTION 10 kb 7 kb ENZYME Eco RI 3 kb 8 kb ENZYME Hind III 2 kb 5 kb 3 kb ENZYMES Eco RI + Hind III 2 kb EcoRI Hind III 3kb 5kb 2kb

29 AUTRES ENZYMES - Les polymérases - L’ADN polymérase I - Le fragment de Klenow de la Pol I - La Taq polymérase - Les ARN polymérases - La transcriptase réverse - Les ligases (ADN ligase, T4 DNA ligase), nucléases (DNASe I, nucléase S1).

30 MERCI POUR VOTRE ATTENTION