Les enzymes de restriction

Présentation au sujet: "Les enzymes de restriction"— Transcription de la présentation:

1 Les enzymes de restriction
Biologie Moléculaire Les enzymes de restriction

2 Enzymes de Restriction
Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes

3 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes
La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

4 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’
Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’

5 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches

6 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes

7 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes

8 Compatibilité des Extrémités
Extrémités franches HO P OH O P Compatible

9 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

10 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible

11 Compatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible

12 Cartes de Restrictions

13 Cartes de restrictions
Déterminer les positions des sites de restrictions Cartes d’ADN linéaires Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Cartes d’insertions dans un vecteur Cartographie des génomes Analyse Southern

14 Approche Déterminer si l’ADN a été digéré
La digestion est elle complète ou partielle? Combien de coupures? Déterminer les positions relatives

15 L’ADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Échelle Témoin
Quelles échantillons n’ont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 1 2 3 4

16 La digestion est-elle complète?
Digestion complète Toutes les molécules d’ADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles

17 Digestion complète Digestion

18 Digestion partielle: partielle non digéré

19 Digestion partielle partielle Digestion

20 La digestion est-elle complète ou partielle?
Échelle Témoin 1 2 3 4 Comparez au témoin Vérifiez l’intensité des bandes Vérifiez les tailles

21 Déterminer les positions relatives
Combien de coupures? Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites

22 Cartes d’ADN linéaires
Enzyme Fragments (Kb) HindIII 3 et 4 SalI 2 et 5 HindIII + SalI 2 et 3 7.0 3.0 4.0 HindIII HindIII + SalI 2.0 3.0

23 Cartes d’ADN circulaires (plasmides)
Enzyme Fragments (Kb) BamHI 2, 3 et 5 HindIII 1 et 9 BamHI + HindIII 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 3.0 2.0 1.0 1.5 2.5 7.0 10.0 1.0 9.0 10.0

24 Plasmides recombinants
SCM X Digéré avec X Vecteur

25 Plasmide recombinant + Insertion X Recombinant Vecteur + insert

26 Déterminer la carte de restriction d’un insert
Étape 1: Déterminer le site d’insertion + Insertion X Couper avec X

27 Cartes d’insertions Taille totale Taille de l’insertion
7.7Kb Taille de l’insertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb Site d’insertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI Enzyme Fragments BamHI 7.7Kb EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0

28 Déterminer l’orientation relative
Le site d’insertion delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite

29 Déterminer l’orientation relative
X A X Orientation 2 A X A X

30 Cartographie relative
Sites a cartographier Enzyme Fragments Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI 7.7Kb 1 EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb 3 2 PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0 Site d’insertion

31 Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb
5.0

32 Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0

33 Analyse de restriction d’ADN complexe
Buts Trouver la position d’une séquence dans des gros fragments d’ADN Déterminer le nombre de copies d’un gène Trouver des séquences similaires dans d’autres organismes Analyse d’ADN non-séquencé dans un organisme inconnu

34 Digestion d’ADN complèxe
Le nombre de fragments rend l’analyse impossible

35 Analyse Southern Séparer les fragments d’ADN d’après leurs tailles
Dénaturer Hybridation avec une sonde simple brin qui représente la région d’intérêt La sonde permet de visualiser seulement la région d’intérêt

36 Southern Sonde Gel d’agarose Hybridation à la sonde