Introduction aux biopuces et à l’analyse du transcriptome

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1 Introduction aux biopuces et à l’analyse du transcriptome
Emmanuel Prestat Transcriptome

2 Les différentes puces Mesures d’expression Etude du nombre de copies
Analyse de polymorphisme Puces à tissus, à cellules, à immunoprécipition Transcriptome

3 Mesures d’expression Biopuces les plus utilisées à ce jour (premières auxquelles on pense, quand on parle de puces à ADN) Principe : les sondes, petits fragments d’ADN (20 à 50 nt) complémentaires à chaque gène ciblé, sont déposées sur une lame de verre, type lame de microscope ; Les cibles, ARNm ou ADNc issus d’ARNm, sont marquées (radioactivité ou fluorescence) puis hybridées avec la lame sur laquelle les sondes sont déposées Transcriptome

4 Transcription Transcriptome

5 La technologie des puces bifluorescentes
Transcriptome

6 Dépôt des sondes (« spotting »)
Transcriptome

7 Dépôt des sondes (« spotting »)
Montrer les lames Transcriptome

8 Puces à oligo : pas de « spotting » !
Procédé Affymetrix (et NimbleGene…) Parler du fait que NimbleGene a tout piqué à Affy. Transcriptome

9 Particularités des puces Affymetrix
La fabrication in situ des sondes Leur ultra-haute densité : jusqu’à 1,3 millions d’objets Leur design : Objets carrés Pas d’espace entre eux Concept de probeset Concept de PM et MM Expliquer ce que l’on entend lorsque l’on parle de design. Transcriptome

10 Puces Affymetrix Transcriptome

11 Préparation des échantillons (cibles)
Extraction d’ARN Kit Amplification PCR Marquage Radioactivité (S35, P32) Fluorescence (Cy3 - vert, Cy5 - rouge)  En général réalisé en même temps que l’amplification: utilisation d’une amorce de PCR marquée Digestion (λ-exonucléase)  ADN simple brin Transcriptome

12 L’hybridation Séchage des cibles et reprise dans un tampon d’hybridation Volume d’hybridation : 3 à 50 μl (entre lame et lamelle)  attention à l’évaporation !  à répartir sur l’ensemble de la surface de la puce Température d’hybridation 45  65°C + la température ↑, + le signal d’hybridation ↓ + la température ↓, + l’hybridation aspécifique ↑ Temps d’hybridation 1h  12h  dans une chambre d’hybridation Transcriptome

13 Le lavage Après hybridation, lavage de la lame, pour éviter
L’adsorption de fluorescence sur le support Les hybridations aspécifiques Conditions de lavage : Dans des solutions de plus en plus stringentes Evaluation de la qualité du lavage (et de l’hybridation) Témoins positifs et négatifs Répartition aléatoire sur la lame  vérification : pas d’effet de localisation, de bord Savez-vous ce que veut dire la stringence d’une solution ? Transcriptome

14 Acquisition des images
Extraction des données Excitation Amplification du signal (PMT) Émission Laser 1 Laser 2 Fluorescence verte Fluorescence rouge (Ech 1) (Ech 2) Parler des couleurs : fluorophore violet excité en rouge… Acquisition de deux images en noir et blanc (niveaux de gris) Introduire la notion de 16bits. Transcriptome

15 Acquisition des images
Etat excité Etat stable Spectre d’excitation & Spectre d’émission Transcriptome

16 Choix des fluorochromes
Fluorescence verte Fluorescence rouge Transcriptome

17 « Vrais » images et images d’« interprétation »
Transcriptome

18 Pas si simple… Transcriptome

19 Pas si simple… Queues de comètes Bavures Spotting ? Lavage ?
Mauvais blocage du processus pendant la phase d’hybridation Sondes/Cibles Spotting ? Lavage ? Transcriptome

20 Pas si simple… …etc Transcriptome

21 Différences avec les puces radioactives
Marquage radioactif (!) Une seule condition expérimentale Le support est une membrane Maximum : 2400 dépôts par membrane (on les appelle parfois les macroarrays) Cette technologie est de moins en moins utilisée au profit des deux autres. Transcriptome

22 Extraction des données à partir de l’image
Adressage – Localisation Segmentation Extraction de l’information (pour chaque spot) - signal d’intérêt - bruit local (autour de chaque spot) - morphologie (surface, périmètre…) Parler des différentes méthodes de segmentation (ça peut les intéresser) : cercles fixes, cercles adaptables, histogrammes, formes adaptables, morphologie mathématique, graines et extentions, … La localisation correspond à l’application de la grille Transcriptome

23 Méthodes de segmentation
Cercles fixes Transcriptome

24 Méthodes de segmentation
Cercles fixes / rotation & distorsions ! GenePix Pro 4.0 Cercles fixes / variabilité du spot Transcriptome

25 Méthodes de segmentation
Cercles adaptables : modifier position du cercle modifier la taille du cerle Transcriptome

26 Méthodes de segmentation
Dérivée seconde Détection de contours Transcriptome

27 Méthodes de segmentation
Détection de contours vs cercles fixes Transcriptome

28 Méthodes de segmentation
Adams R et Bishof 1994 Détection de régions (graines ou agrégation de pixels) Transcriptome

29 Méthodes de segmentation
Détection de régions (Watershed Function) Morphologie mathématique Détection de régions : seuillage (ou histogrammes) Transcriptome

30 Mesure du bruit de fond Transcriptome

31 Quelques chiffres Diamètre des spots : µm Capacité totale : spots / lame ; 2-10 ng ac.nucl./spot Distance entre les spots : 100 µm – 600 µm Durée de conservation : 9 mois Conditions optimum de conservation : 2 – 8 °C Durée totale de préparation : 3 jours Préparation d’un échantillon : 2 jours Hybridation : 16 heures Lavage : 1 heure Scan : minutes Transcriptome

32 Normalisation de biopuces : pourquoi ?
«Traitement visant à ajuster les données selon les effets des variations dues à la technologie plutôt qu’à des différences biologiques » Yang et al. 2002 Transcriptome

33 Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Transcriptome

34 Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Effet microplaque (ou aiguille) Transcriptome

35 Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Transcriptome

36 Normalisation de biopuces : pourquoi ?
Après normalisation qui tient compte de la variabilité due aux différentes aiguilles du « spotter ». Rmq : la normalisation inter-lames observe le même principe Transcriptome

37 Analyse de données Identification de gènes DE
Fold change Tests statistiques Identification de gènes DE (plus de 2 conditions) Répétitions (quel type, combien ?) Transcriptome

38 Fold change Avantage : sens pour un biologiste Décision :
Fold Change =expression value sample 1/ expression value sample 2 Décision : Quel seuil ? Même pour tous les gènes Inconvénients Seulement les valeurs moy, sans tenir compte de la variabilité sont considérées Les gènes ayant une expression très variable, ont plus de chance de dépasser le seuil aléatoirement Transcriptome

39 Tests à un facteur Transcriptome

40 Tests à un facteur Paramétriques Condition de normalité
Transormation Log => Transformer les données ! Transcriptome

41 Tests à un facteur Tests non paramétriques
Ne supposent pas la normalité Ne supposent pas l’homoscédasticité L’utilisation des rangs à la place des valeurs d’intensité : Diminue l’effet des outliers Ne sont pas affectés par la log-transformation Pas recommandés si les échantillons ont peu de répétitions Transcriptome

42 Volcano plot Combine les p-values et fold changes
Qu’est-ce qui est biologiquement important ? La significativité des différences Leur valeur Quels seuils ? Combien veut-on identifier de gènes ? Où sont les contrôles ? Le t-test modéré fait quelque-chose de similaire Transcriptome

43 Quel seuil de p-value choisir ?
Dépend du type d’erreur Type 1 Faux positifs => identifie des gènes différentiellement exprimés alors qu’ils ne le sont pas Type 2 Faux négatifs => ne détecte pas certains gènes pourtant différentiellement exprimés dans la réalité Transcriptome

44 Correction des tests multiples
Le problème… Ho = l’expression moyenne du gène X est la même pour toutes les populations comparées Identification des gènes DE : autant de tests à faire que de gènes considérés Nombre moyen de faux positifs : G. Exemple G = gènes  = 0.05 => G. = 1250 faux positifs… Transcriptome

45 Correction des tests multiples
Méthodes de correction des p-values Correction FWER (Family-Wise Error Rate) FWER = proba- d’obtenir au moins 1 faux positif Méthodes utilisées : Bonferroni Bonferroni step-down (Holm) Westfall and Young permutation Correction FDR (False Discovery Rate) FDR = taux attendu de faux positifs Méthode utilisée Benjamini et Hochberg Transcriptome

46 Lequel utiliser ? FWER: ne tolère pas de faux positifs (Ho est difficilement rejeté) => procédure très conservative FDR : moins conservatif, on estime le pourcentage de FP parmi les gènes « appelés » Aucun : le pourcentage de FP est estimé sur l’ensemble des gènes testés Transcriptome

47 Tests bi-facteurs ANOVA Comme un t-test avec + de deux conditions
Mesure les effets de différents facteurs ainsi que leurs interactions ANOVA 2 Test deux facteurs 3 tests Temps Traitement Interaction entre les 2 (additif ? Multiplicatif ?) Transcriptome

48 Importance des répétitions
Les moyennes sont moins variables que les valeurs individuelles. Les répétitions permettent de faire des tests statistiques. Transcriptome

49 Classification But : Regrouper une collection d’objets de façon à ce que les objets d’une partition soient plus liés entre eux qu’avec les objets d’une autre partition Analyse discriminante (classification supervisée) : les classes sont définies Classification (non-supervisée) : on ne connaît pas les classes Transcriptome

50 Classification Exemples :
Traitement/contrôle, malade/normal, thérapie efficace/sans succès,… Si on a des informations sur la façon de classer les échantillons, elles devraient être intégrées dans la méthode Transcriptome

51 Les données Caractéristiques C
B C Different classes of experimental conditions, e.g. Cancer types, tissues, drug treatments, time survival, etc. Caractéristiques La plupart des gènes sont non-informatifs pour le trait étudier Le nombre de variables est plus important (plusieurs ordres de magnitude) que le nombre d’expériences Expression profile of all the genes for a experimental condition (array) Genes (thousands) Expression profile of a gene across the experimental conditions Experimental conditions (from tens up to no more than a few houndreds) Transcriptome

52 Classification : corrélations et distances
Pearson : corrélation entre les valeurs Sperman : corrélation de rangs (réduit l’effet des variations extrèmes) => Prend en compte les tendances Spearman confidence (mesure de similarité) = 1 - p-value Distance euclidienne => différences entre coordonnées Distance de manhattan (somme des différences absolues pour toutes les coordonnées du vecteur) => plus robuste Transcriptome

53 Classification hiérarchique
Arbre des gènes Arbre des conditions Exemple : UPGMA Transcriptome Alizadeh et al., Nature 2000

54 Classification non-hiérarchique
K-means : minimisation de la variance intra-classe (le nombre de classes est une instance) ACP : rotation de la base maximisant les variances SOM (Self Organising Maps) Transcriptome

55 Classification supervisée = « class prediction »
Quelques méthodes: Bayes Analyse discriminante linéaire Les k plus proches voisins (k-NN) Les arbres de classification (CART) Transcriptome

56 Autre type de puce analysant le transcriptome
Puces à exons : Analyse de l’épissage Transcriptome

57 Principe du CGH Transcriptome
Donc la méthode de puces est donc là pour augmenter la résolution de la CGH « classique ». Transcriptome

58 Analyse des puces CGH Transcriptome

59 Objectifs de l’étude statistiques
Transcriptome

60 Analyse de polymorphisme
Les Single Nucleotide Polymorphims (S.N.P) désignent des variations d'une seule paire de base du génome, entre individus d'une même espèce (e.g. 1/1000 paire de bases dans le génome humain). On parlera de formes alléliques synonymes dans le cas où plusieurs formes d'un SNP mènent à la même séquence polypeptidique, et de formes non-synonymes dans le cas où les séquences produites diffèrent. Les SNP qui se retrouvent dans des régions non-codantes peuvent avoir des conséquences sur l'épissage, les facteurs de transcription, ou sur les séquences d'ARN non-codant Transcriptome

61 Les SNP Une séquence d'ADN contenant un site SNP. Les allèles A et G sont illustrés. Une région chromosomique où seuls les SNP sont montrés. Trois haplotypes sont illustrés. Les deux SNP colorés suffisent à identifier (marquer) chacun des haplotypes. Par exemple, si les deux sites SNP marqueurs du chromosome portent les allèles A et T, on peut déduire qu'il s'agit du premier haplotype. Transcriptome

62 Puces SNP Exemple : Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0
1.8 million markers for genetic variation single nucleotide polymorphisms (SNPs) 946,000 probes for the detection of copy number variation Transcriptome

63 ChIP-on-Chip (étude des points de contacts entre une protéine et tout le génome)
Transcriptome

64 Problématique biologique du TP
Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la majorité des pucerons. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants. Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères (adaptatives ?). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple) -> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable) Le génome de Buchnera est « dégénéré » -> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ? -> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins nutritionnels de l’hôte ? Transcriptome

65 La puce Buchnera 3ème oligo bloc (12 x 16) Oligo 3’ Oligo 5’
Contrôles (+ et -) Doublets de spots Oligo 5’ Oligo 3’ 3ème oligo Superposition des 2 images (R et G) aiguille 1 aiguille 2 aiguille 3 aiguille 4 = Transcriptome

66 Plan expérimental du TP
Approche comparative (non cinétique) Expérience Naas (16 lames) : Milieu équilibré Milieu déséquilibré en AA en AA riche en saccharose A B pauvre en sacharose C D 2 répétitions indépendantes de 8 lames : A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A A B C D -> Les données ont été acquises par N. Reymond (expérience naas.tri analysée en TP) Transcriptome