Cristallisation du lysozyme en 1H réalisée en goutte pendante à température ambiante (22°C) par Arnaud Leroy (Univ. Paris SUD UMR CNRS 8525) Bernard.

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1 Cristallisation du lysozyme en 1H réalisée en goutte pendante à température ambiante (22°C) par Arnaud Leroy (Univ. Paris SUD UMR CNRS 8525) Bernard Clantin (IPL et IBL UMRCNRS 8161 ) D’après le protocole décrit dans le manuel Hampton Research Vol 13 n° page 32 Casting La laborantine: Kaixuan Feng (Un grand merci à Kaixuan pour sa collaboration gracieuse et pour certaines prises de vue) Le prof mandarin ‘busterkeatonien’: Arnaud Leroy Dans le rôle principal: Le lysozyme Scénario: Arnaud Leroy Droits : CreativeCommons Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

2 Fonctions du Lysozyme Le Lysozyme est un enzyme important qui dans le blanc d’œuf de poule sert à la protection de l’embryon en lysant la paroi des bactéries de l’environnement invasives de l’œuf. Il joue le même rôle au niveau de la muqueuse pulmonaire en empêchant le développement de bactéries opportunistes issues de l’environnement, d’où l’importance de l’étude de sa stabilité pour son utilisation dans les traitements de la mucoviscidose. Le Lysozyme est une protéine cristallisable, dont la structure tridimensionnelle a été établie par diffraction des Rayons X à partir des cristaux et confirmée en phase liquide par RMN. Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

3 Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot Lys1 N-term Leu129 C-term De ces cristaux une structure a pu être déterminée par diffraction des rayons X (RX)

4 Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot Le site actif se situe à l’interface des régions structurées en feuillet beta et en hélice alpha dans la trouée structurale définie par ceux-ci Lys1 N-term Leu129 C-term À l’aide de ‘Rasmol’ et des coordonnées de diffraction RX déposées dans la PDB (Protein Data Bank) de ces cristaux on peut générer un modèle moléculaire avec lequel on peut jouer: faire apparaître les structures secondaires ou mettre en évidence en pratiquant des rotations du modèle, une cavité (ici du site actif)

5 Le site actif se situe à l’interface des régions structurées
en feuillet beta et en hélice alpha dans la trouée structurale définie par ceux-ci Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

6 Le site actif se situe à l’interface des régions structurées
en feuillet beta et en hélice alpha dans la trouée structurale définie par ceux-ci Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

7 Pour Cristalliser le lysozyme vous avez deux possibilités aussi simple l’une que l’autre:
Soit faire ‘faire’ le boulot en restant décontracté les pieds allongés sur un bureau. La solution pour laquelle tout glandeur ‘définitif’ optera. Ou soit le faire vous-même en suivant le protocole décrit ci-après Pour cristalliser une autre protéine, il vaut mieux vous munir de sens de l’humour* ou d’un robot pour tester des multitudes de milieu de cristallisation (pH, température, temps, force ionique, aditifs et/ou n’importe quel perlimpinpin requis). * ‘L’humour(iste) est là pour désacraliser les choses en faisant des pirouettes autour de l’ordre établi.’ Jean Yanne. Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

8 Bon, je vais aller me boire un coup à l’annexe, en face. Mais il
faut que je mette la main sur ma post doc: Kaixuan Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

9 Dans notre cas il nous faut trouver une belle grande souris de laboratoire qui compatit et tient à vous éviter tout surmenage à la paillasse. Pas toujours facile, et impérativement il faut lui expliquer que c’est pas chinois. Que c’est à la portée de n’importe qu’elle souris, même pas de laboratoire et même à des souris qui ne seraient pas de l’université, mais d’un lycée, pour qu’enfin elle lâche son téléphone pour se mettre au boulot. Ce qui accessoirement, permet à des rats de bibliothèques et de bistrots, de continuer à faire fructifier celles-ci et à renouveler leurs stocks, ainsi que de soutenir le petit commerce local. Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

10 J’ai enfin trouvé la souris qui s’était planquée dans mon bureau
Comment ça pas Chinois!!! On voit que c’est pas monsieur qui fait le boulot! Ah bon! Tu vas m’expliquer et c’est facile. Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

11 Conditions de cristallisation Lysozyme à 50 mg/mL dans 0
Conditions de cristallisation Lysozyme à 50 mg/mL dans 0.1M d’acétate de sodium pH 4.5 Réactif : 8% chlorure de sodium dans 0.1M d’acétate de sodium pH 4.5 Mélanger un volume équivalent de la solution de lysozyme avec le réactif et laisser équilibrer en goutte pendante à 22°C en présence de réactif au fond du puits qui contient la goutte pendante. Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

12 Solution précipitante
Technique de la goutte pendante Lysozyme à 25 mg/mL dans 0.1M acétate de sodium et à 4% NaCl pH 4,5 Verre siliconé Solution précipitante 0.1M acétate de sodium et à 8% NaCl pH 4,5 Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

13 T=0 min Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot

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28 T = 1 heure Instrulabo InstruL2 formation Idenatprot