Les enzymes de restriction

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1 Les enzymes de restriction
Biologie Moléculaire Les enzymes de restriction

2 Enzymes de Restriction
Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes

3 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes
La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

4 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Palindromes
La base à une position determine la base coresspondante à la même position sur l’autre brin 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’

5 Palindromes CAC_ _ _ GT _ TA _ AT _ _ AT _ _ CACGTC GTATAC ATATATAT
Complétez les palindromes suivants CAC_ _ _ GT _ TA _ AT _ _ AT _ _ CACGTC GTATAC ATATATAT

6 Palindromes Problème Combien de palindromes de 4 bases sont possibles?
N1N2N3N4 Position 1: 4 choix (A, G, C, ou T) Position 2: 4 choix (A, G, C, ou T) Position 3: 1 choix (déterminer par la position 2) Position 4: 1 choix (déterminer par la position 1) Donc: 4 X 4 X 1 X 1 =16

7 Combien de palindromes est-ce que l’enzyme AccI reconnaît?
Problème Combien de palindromes est-ce que l’enzyme AccI reconnaît? GTMKAC (M= A ou C; K = G ou T) 1 X 1 X 2 X 1 X 1 = 2

8 Fréquence d'occurrence
Probabilité de retrouver un palindrome donnée Dépend de la distribution des bases Ex. 50% G ou C ou 1/4 pour chaque base Quelle est la probabilité d’occurrence de GGATCC? 1/46 ou 1 divisé par (0.25)-6 = 1/4096 Combien de fois est-ce que cette enzyme serait prévue de couper dans un génome de 10 kb? 1/4096 X = 2.44 Arrondir au chiffre entier le plus proche. Donc 2X

9 Fréquence d’occurrence
Problème Quelle est la probabilité de retrouver n’importe quel palindrome de 4 base dans un génome qui est 50% G ou C Nombre de différentes séquences de 4 bases 44 = 256 Nombre de différent palindromes de 4 bases 4 X 4 X 1 X 1 = 16 Probabilité de retrouver un palindrome de 4 bases 16/256 = 1/16

10 Fréquence d’occurrence
Distribution inégale des bases Déterminer la séquence de chaque palindrome possible Déterminer la probabilité de chaque palindrome d’après la distribution des bases Déterminer la somme des probabilités Ex. AccI coupe GTMKAC (M= A ou C; K = G ou T) Distribution des bases: 70% G/C, 30% A/T 2 palindromes possible GTATAC: (0.35)(0.15)(0.15)(0.15)(0.15)(0.35) = 1/16125 GTCGAC: (0.35)(0.15)(0.35)(0.35)(0.15)(0.35) = 1/2962 Probabilité: 1/2502

11 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Clivage
Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’

12 Différentes extrémités sont générées
3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches

13 Différentes extrémités sont générées
3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes

14 Différentes extrémités sont générées
3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes

15 Compatibilité des extrémités
Extrémités franches HO P OH O P Compatible

16 Compatibilité des extrémités
Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

17 Compatibilité des extrémités
Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible

18 Compatibilité des extrémités
Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible

19 Extrémités compatibles
Quels sites de restriction de la liste 1 génèreraient des extrémités qui seraient compatibles avec ceux générées de la liste 2? Liste 1 GA▼TATC AAAT ▼ TT CGC ▼ CGC A ▼ CGCGT Liste 2 CCAT ▼ GGC CAC ▼ GTG CCGC ▼ GG CCATAT ▼ ATGG 2+A & 2+D

20 Cartes de Restrictions

21 Cartes de restrictions
Déterminer les positions des sites de restrictions Cartes d’ADN linéaires Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Cartes d’insertions dans un vecteur Cartographie des génomes Analyse Southern

22 Approche Déterminer si l’ADN a été digéré
La digestion est elle complète ou partielle? Combien de coupures? Déterminer les positions relatives

23 L’ADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Échelle Témoin
Quelles échantillons n’ont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 1 2 3 4

24 La digestion est-elle complète?
Digestion complète Toutes les molécules d’ADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles

25 Digestion complète Digestion

26 Digestion partielle: partielle non digéré

27 Digestion partielle partielle Digestion

28 La digestion est-elle complète ou partielle?
Échelle Témoin 1 2 3 4 Comparez au témoin Vérifiez l’intensité des bandes Vérifiez les tailles

29 Déterminer les positions relatives
Combien de coupures? Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites

30 Cartes d’ADN linéaires
Enzyme Fragments (Kb) HindIII 3 et 4 SalI 2 et 5 HindIII + SalI 2 et 3 7.0 3.0 4.0 HindIII HindIII + SalI 2.0 3.0

31 Cartes d’ADN circulaires (plasmides)
Enzyme Fragments (Kb) BamHI 2, 3 et 5 HindIII 1 et 9 BamHI + HindIII 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 3.0 2.0 1.0 1.5 2.5 7.0 10.0 1.0 9.0 10.0

32 Plasmides recombinants
SCM X Digéré avec X Vecteur

33 Plasmide recombinant + Insertion X Recombinant Vecteur + insert

34 Déterminer la carte de restriction d’un insert
Étape 1: Déterminer le site d’insertion + Insertion X Couper avec X

35 Cartes d’insertions Taille totale Taille de l’insertion
7.7Kb Taille de l’insertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb Site d’insertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI Enzyme Fragments BamHI 7.7Kb EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0

36 Déterminer l’orientation relative
Le site d’insertion delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite

37 Déterminer l’orientation relative
X A X Orientation 2 A X A X

38 Cartographie relative
Sites a cartographier Enzyme Fragments Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI 7.7Kb 1 EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb 3 2 PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0 Site d’insertion

39 Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb
5.0

40 Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0

41 Analyse de restriction d’ADN complexe
Buts Trouver la position d’une séquence dans des gros fragments d’ADN Trouver des séquences similaires dans d’autres organismes Analyse d’ADN non-séquencé

42 Digestion d’ADN complèxe
Le nombre de fragments rend l’analyse impossible

43 Analyse Southern Séparer les fragments d’ADN d’après leurs tailles
Dénaturer Hybridation avec une sonde simple brin qui représente la région d’intérêt La sonde permet de visualiser seulement la région d’intérêt

44 Southern Sonde Gel d’agarose Hybridation à la sonde

45 Problème Des fragments de quelles tailles serait observés avec les sondes 1 et 2 après des digestions simples avec chacune des enzymes

46 Solution Enzyme Sonde 1 Sonde 2 C 2.5 & 11kb 11kb K >11kb
X >9.8 & 10.2kb >9.8kb