LES METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

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1 LES METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

2 La cellule est l’unité structurale et fonctionnelle fondamentales des organismes vivants et en raison de sa petite taille, la biologie cellulaire à, tout d’abord, besoin d’en obtenir une image agrandie de bonne qualité. Les microscopes utilisent la déviation d’un flux ondulatoire de particules, soit les photons , soit les électrons au travers d’un système de lentilles de manière à former d’un objet à étudier une image agrandie. Afin d’observer des détails encore plus fins, il faut augmenter la résolution, qui est généralement proportionnelle à la longueur d’onde de la radiation utilisés pour interférer avec les structures étudiées.

3 La microscopie optique
Les microscopes optiques (à lumière ou photoniques) permettent l’observation de cellules vivantes ou mortes, grâce à des coupes très fines de préparations fixées. Les microscopes optiques utilisent de la lumière visible. Son pouvoir séparateur ou limite de résolution est de 0,2 μm. On obtient un grossissement x1000 Le pouvoir séparateur est la capacité de distinguer deux points adjacents comme distincts. L’œil a la capacité de distinguer des particules d'un diamètre pouvant atteindre 0.1 μm. Toutefois, elles doivent être séparées entre elles d'une distance d'au moins 5 μm. Le pouvoir séparateur de l’œil est de 5μm.

4 Microscope électronique
Les microscopes électroniques utilisent des faisceaux d’électrons qui sont chargés, possèdent une masse et se comportent comme une onde. Plus les électrons sont accélérés et plus la résolution augmente. On obtient ici un grossissement x 100 000. Le pouvoir séparateur du microscope électronique est de 0,2 nm et est 1 000 fois plus élevé que pour le microscope optique.

5 Dans ces microscopes, le faisceau de photons est remplacé par un faisceau l’électrons émis sous vide, accélérés par une forte différence de potentiel et canalisés par une série de lentilles (électro- magnétiques). Le microscope est équipé de trois système de lentilles transparentes (verre). Un condenseur D1 concentre la lumière sur l’objet Un objectif et un oculaire L1 et L2 grossissent l’image.

6 Fixation Déshydratation Inclusion Coupe
Observation microscopique de la cellule Techniques de préparation des coupes : En microscopie optique ou électronique, la préparation comporte généralement 4 étapes: Fixation Déshydratation Inclusion Coupe

7 la méthode de coupe

8 LA FIXATION Préserve la structure de la cellule morte
Les méthodes de fixation : Fixateurs Tuent la cellule en gardant en place ses constituants Formaldéhyde ou glutaraldéhyde, tétroxyde d'osmium, moyens physiques (ex: basses températures)

9 DESHYDRATATION L'eau est retirée de la cellule au cours de passages successifs dans des bains d'alcool de plus en plus concentré.

10 INCLUSION Le milieu d'enrobage, ou d'inclusion est miscible avec la solution servant à la déshydratation Milieu intermédiaire: xylène, toluène…… Le milieu d'enrobage plastiques de type paraffine ou résine époxy (remplace complètement le toluène) Le milieu d'inclusion doit passer de l'état liquide à l'état solide avant d'être coupé (cette solidification s'effectue par polymérisation).

11 COUPE DU SPÉCIMEN Copper niesh gril Microscope s'ide

12 OMBRAGE METALLIQUE Charpente cellulosique de la paroi végétale
Virus de la Mosaique du tabac

13 COLORATION NEGATIVE Virus de la mosaïque du tabac (VMT

14 Cryofracture et Cryodécapage

15 Cryofracture et Cryodécapage

16 Cryofracture et Cryodécapage

17 Cryofracture et Cryodécapage

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19 La microscopie

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22 Microscope électronique à transmission

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24 Différences principales entre le M.O et le M.E
Les microscopes optiques Les microscopes électroniques Faisceau lumineux (photons) Faisceau d’électrons Lentilles en verre Lentilles électromagnétiques (champs) Grossissement x fois Grossissement x fois Résolution (0,2 μm) Résolution (peut atteindre 0.05 nm) L’image : est observée directement par les oculaires. L’image : est reçue sur un écran fluorescent. les coupes au microtome : 2 à 10 μm les coupes à l’ultramicrotome : 0,05μm

25 Microscope optique à fluorescence

26 Principe du fonctionnement

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28 Les fluorochromes λexc < λem
Un fluorochrome est une molécule chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation λexc < λem

29 Les molécules fluorescentes utiles en biologie cellulaire
Le DAPI Le DAPI ou 4',6-diamidino-2-phénylindole est une molécule fluorescente capable de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. Quand le DAPI absorbe la lumière UV (350 nm), il émet une fluorescence bleue brillante ( nm) 2, ce qui permet de détecter et quantifier l'ADN grâce à un microscope à fluorescence .

30 Fluorescéine et ses dérivés
• Fluoriscine: absorbe le Bleu (490 nm) et émet le Vert (520 nm). exemple : anticorps marqué à la fluorescéine Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés de la fluorescéine comme le FITC (Fluoresceine Iso Thio Cyanate).

31 Rhodamine et ses dérivées
Rhodamine: absorbe Vert (541 nm) et emet du Rouge (572 nm). Squelette des rhodamines Tetramethylrhodamin isothiocyanate, TRICT, une molécule construite sur le squelette rhodamine de base (3-désoxy-4,12-diamino-8-phényl-fluorone) est réactive vis-à-vis des groupements amine de protéines dans une cellule in vivo.

32 Représentation de deux cellules de souris en phase de division cellulaire tardive (télophase). l'ADN est visible en bleu (coloration au DAPI).

33 Cellules endothéliales d'une artère pulmonaire bovine (noyaux colorés en bleu avec du DAPI, microtubules marqués en vert par un anticorps lié au FITC et filaments d'actine marqués en rouge par de la rhodamine).

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35 immunofluorescence

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37 Autoradiographie La technique est ici appliquée à des coupes traitées pour la microscopie photonique. Les cellules analysées ont incorporé, avant le traitement, un précurseur radioactif spécifique de l’ADN (thymidine tritiée), de sorte que seuls les noyaux apparaîtront marqués après développement de l’émulsion. (1) Coupes de cellules marquées collées sur une lame de verre. (2) Coulage d’une émulsion photographique à l’obscurité. (3) Aspect des coupes de cellules après développement de l’émulsion. (a), (b) et (c) : aspect en coupe des préparations 1, 2 et 3 ; (d) : secteur agrandi de (c).

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