Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique. L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.

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1 Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis

2 Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique. L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.

3 Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour d’autres transferts de macromolécules que celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV

4 Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV
(Covacci et al, 1999)

5 Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens
(Covacci et al, 1999) B1 Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB

6 La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis
La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis. - Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l ’homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des a-2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique d’endocytose.

7 Dégradation enzymatique Vacuole de réplication
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Interaction phagosome Brucella Autophagosome Endosome précoce Interaction Endosome tardif Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV Lysosome Dégradation enzymatique Vacuole de réplication

8 (O ’Callaghan et al, 1999) Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d ’identité moyen de 26% (19,5 à 31 %)

9 Objectif de ce travail : Utilisation d ’une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV d’Agrobacterium tumefaciens à Brucella suis.

10 Les étapes suivies : 1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires ) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction

11 La méthodologie : 1) Recherche d’homologues (Blast)
- Banque non redondante - Banque de structures (PDB) - Banque d’ESTs humaines Les composants des systèmes de type IV La relation structure/fonction Interaction avec l’hôte 2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT) - 4 localisations - Ne prédit pas encore la sécrétion - Prédictions fiables (cas-tests) - Localise une peu trop souvent en membrane interne

12 La méthodologie (suite) :
3) Détection de motifs a) Caractérisation d’une famille protéique (Blocks) b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite) 4) Prédiction de structures secondaires (PHD) - Localisation des structures secondaires - Prédiction d’hélices transmembranaires - Prédiction des résidus enfouis et exposés - Validation des localisations sub-cellulaires

13 La méthodologie (fin) :
5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe) - Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction

14 Agrobacterium tumefaciens
Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis Agrobacterium tumefaciens Brucella suis B1

15 Conclusions du débroussaillage :
- 8 protéines du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis. - Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5.

16 La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes

17 La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.

18 Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables

19 Lysozyme complexé avec du NAG

20 La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A)

21 VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.
Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa) (ProDom) PD000002 (K/R)(K/R)(D/E) Motif de liaison aux microtubules Ce qui s ’aligne À VirB5 N C VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.

22 Ce bloc PD est conservé par beaucoup d’autres familles protéiques. Il s ’agit en fait d’un coiled coil

23 Voici un échantillon des protéines qui partagent ce motif coiled coil:
Protéines liant l’ADN : - protéines activatrices - élément de dimérisation de facteurs de transcription Apolipoprotéines Protéines fibreuses Famille des v-SNARE et t-SNARE Intéressant

24 Schéma d’interaction entre v-SNARE et t-SNARE
Membrane vacuolaire Membrane organite RE, Golgi

25 Dégradation enzymatique Vacuole de réplication
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Interaction phagosome Brucella Autophagosome Endosome précoce Interaction Endosome tardif Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV Lysosome Dégradation enzymatique Vacuole de réplication

26 Conclusions : - Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens à B. suis. - VirB1 dégraderait le peptidoglycane - VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire - Discussion sur la méthode employée

27 Perspectives : - Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif d’un lysozyme (mutagenèse dirigée) - Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co-immunoprécipitation, …). - Analyse approfondie d’autres composants du complexe.