Reconnaissance bactérienne chez Drosophila melanogaster

Présentation au sujet: "Reconnaissance bactérienne chez Drosophila melanogaster"— Transcription de la présentation:

1 Reconnaissance bactérienne chez Drosophila melanogaster
Bonsoir a tous, merci de m’accueillir au sein de ce séminaire Inflammation. Je vais vous parler aujourd’hui d’un des aspects développés dans le laboratoire dans lequel j’ai effectué mon DEA et une partie de ma thèse de science et qui fait pendant comme vous allez le voir au sujet de Mr Carbonnel : la reconnaissance des bactéries par le système immunitaire de la drosophile Diapo suivante Sébastien PILI-FLOURY Département d’Anesthésie-Réanimation CHU Jean Minjoz Besançon

2 Réponse anti-infectieuse chez Drosophila melanogaster
1/ Barrières physiques 2/ Réaction cellulaire 3/ Activation de cascades protéolytiques Pour se défendre contre le microorganismes, la mouche ne peut compter que sur son système immunitaire innée. La première ligne de défense est assuré par des barrières physiques et vous voyez sur cette photo de micrososcopie l’épaisse membrane péritrophique qui sépare une cellules de l’intestin de drosophile de bactéries intraluminales. Lorsque cette étape est franchi la drosophile met en place une réaction cellulaire avec des cellules à pouvoir phagocytaire. Elle met aussi en place une réaction humorale avec sécrétion activation de cascades protéolytiques comme celle de la mélanisation et activation de la synthèse systémique ou localisé de peptides antimicrobiens (Diapo suivante) 4/ Synthèse de peptides antimicrobiens

3 La réponse antimicrobienne systémique
Diptéricine Drosocine PP P P P P P P G G G P PP G GG G G PP G G G G G G G P P P P P Metchnikowine Antibactériens (Germes à Gram-négatif) Cellules du corps gras Drosomycine G G G Attacine Cécropines G G G G G G G G G G G La réponse antimicrobienne sustémique est de loin la mieux connu. Ces peptides sont sécrétés par le corps gras, un équivalent fonctionnnel du foie des mammifères et soont des petites molécules cationiques qui possèdent un spectre antiinfectieux plus ou moins sélectif. La diptéririne par exemple a un effet dirigé contre les bactéries à Gram négatif, alors que la drosomycine est surtout un antifongique G G Antifongique G G Défensine Antibactérien (Germes à Gram-positif)

4 Bactéries Gram négatif
2 voies de signalisation contrôlent la synthèse des peptides antimicrobiens Toll Imd Champignons Cocci Gram positif Dif/Dorsal B Drosomycine Bactéries Gram négatif Relish Diptericine Imd dmIKK dmIKKß dTAK1 Dredd D E Relish Rel ANK Antimicrobial peptide genes B DD dFADD Imd pathway ? Cactus DIF Dorsal Toll TIR Tube Pelle Spaetzle Noyau dMyD88 Toll pathway Hemolymph 2 voies de signalisations controlent la synthèse des peptides antimicrobiens, la voie Toll et la voie Imd. L’activation de ces voies aboutit à la translocation nucléaire de molécules de type Nfkappa B (Dif et dorsal pour la voie Toll) et relish pour la voie Imd) qui active la transciption sélective des gènes des peptides anntimicrobiens. Ainsi la drosomycine esty sous le contôle exclusif de la voie Toll alors que la diptéricine est sous le contrôle exclusif de la voie Imd. De plus nous avions remarqué que l’activation de l’une ou de l’autre des voies dépendait des microorganismes infectant, la voie Toll étant activé principalement par les champignons et les cocci à Gram positif alors que la voie Imd était activé par las bactéries à Gram négatif. Cette acivation sélective permet donc à la drosophile de développer une réponse antimicrobienne adaptée au microorganimses infectant Réponse antimicrobienne adaptée

5 Structure(s) candidate(s) ?
PG :PeptidoGlycane LPS : LipoPolySaccharide LTA : Acide LipoTeichoique TA : Acide Teichoïque PG Lipoprotéines LTA LPS Porine Bactérie à Gram-positif Bactérie à Gram-négatif TA Nous nous sommes demandés quelles pouvaient être quelles pouvaient être les structures bactériennes reconnues par le système immunitaire de la drosophile capable d’activer sélectivement les voies Toll et Imd. Vous avez sur cette diapo le shéma de la paroi des deux grandes familles de bactéries, les bactéries à Gram négatif et les bactéries à Gram positif. La différence majeure entre ces deux familles est sonstituté par la présence de lipopolysaccharides à la surface des bactéries à Gram négatif en faisant le candidat idéal pour la reconnaissnce des Gram négatif. L’autre structure particulièrement abondante présent chez les Gram neg et les Gram plus est le peptidoglycan

6 Méthodologie 1/ Ultrapurification de LPS et de PG
2/ Injection de 9,2 nL de produit Nous avons donc purifié du LPS et du peptidoglycan à partir de différentes bactéries à Gram positif et à Gram négatif et nous en avons injecté 9,2nL dans le thorax de drosophiles adultes. Nous avons monitoré l’activité des voies tOll et Imd soit en quantifiant par PCR quantitative l’expression des gènes de Drosomycine pour la voies Toll et de Diptéricine pour la voie Imd, soit en utilisant des mouches possédant un transgène rapporteur fusion entre les séquences promotrices des peptides antimicrobiens et le gène de la beta glactosidase Diapo suivante 3/ Quantification de l’activation des voies Toll ou Imd PCR quantitative en temps réel Gènes rapporteurs et dosage activité β-galactosidase Promoteur Dipt ou Drs gène-lacZ

7 Le LPS n’induit pas la Diptéricine
LPS Com E. coli (µg/ml) LPS purifié E.coli (µg/ml) S.typhi (µg/ml) * Sur cette figure nous avons mesuré l’activité du gène diptéricine-lacZ après injection de quantité croissante de LPS commercial ou de LPS purifié extrait de Coli ou de Salmonella typhy. Les mesures doivent etre rapporté à l’effet observé à l’injection d’eau fixé arbitrairement à 100%. Vous voyez que le LPS purifié n’acive pas la diptéricine comparativement à l’injection d’eau alors que le LPS commercial l’active suggérant que ce LPS est contaminé par une structure capable d’activer la voie Imd (Diapo suivante) * p<0,05 H20 vs LPS

8 Le PG extrait de bactéries à Gram négatif induit la Diptéricine en activant la voie Imd
* * * * * * * * * * * PG purifié E.coli (µg/ml) PG purifié P.aeruginosa (µg/ml) E.coli DO600nm De la même facon nous avons mesuré l’activité diptericine lacZ après injcetion d’eau ou de concentration croissante de PG extrait d’Ecoli et de pseudomonas aeruginosa. Vous voyez que cette fois le PG purifié active la diptéricine avec un maximum d’effet obtenu pour une concentration de PG de l’ordre de 50µg/ml. L’injcetion de PG reproduit l’effet observé après injection d’Ecoli vivant entier. Pour être sur que l’effet obtenu passait par l’activation de la voie Imd nous avons injecté soir de l’eau en blanc ou du PG d’Ecoli en noir à des mouches sauvages ou muté sur la voie Toll et la voie Imd et nous avons quantifiés l’expression du gène de la diptéricine.. Chez le sauvage l’injection de PG permet d’induire la diptéricine. Cette effet est complètement aboli dans les mutants de la voie Imd alors qu’il est préservé dans les mutants de la voie Toll Diapo suivante * p<0,05 H20 vs PG

9 Le PG extrait des Gram positifs du genre Bacillus induit la Diptéricine alors que le PG extraits des Cocci à Gram positif induit la Drosomycine * * PG M.lut. (µg/ml) PG E.fec. PG E.coli.. M.luteus DO600nm * * * * * * * * * * * * * * * * * De la même facçon nous avons injecté du PG issu de bacilles à Gram positif (bacillus thurigensis et bacillus subtilis) et du PG extrait de cocci à Gram positif comme microccus luteus et enterococcus fecalis et mesuré l’activiré dipt lacZ a droite et l’activité drosomycinelacZ à gauche. Le PG extrait des cocci à Gram plus n’active pas la voie Imd mais acyive la voie Toll alors que le PG extrait bacillus active la voie Imd * * * * * * PG B. Thur. (µg/ml) PG B.sub. (µg/ml) PG E. fec. (µg/ml) PG M. lut. (µg/ml) Dipt-lacZ Drs-lacZ * p<0,05 H20 vs PG

10 Structure du peptidoglycane
Nod2 GlcNac MurNac mesoDAP (L-Lys) Nod1 Nous avons donc démontré que le PG était la principale structure reconnu par le système immunitaire de la drosophile? Pour tenter de comprendre d’où venait la discrimination entre les PG nous nous sommes attachés à regarder la structure du PG. Le PG est un enchainemeent d’un motif disaccharidique (Nacetyl glucosamine-Nactétym muramique) formant des chaines reliés entre elle par des pont peptidiques. La différence principale réside dans la nature du 3ieme AA. Il s’agit d’une Lysine pour les cocci à Gram positif et d’acide diaminopimélique pour les bactéries à Gram négatif.et les bacilles à Gram positif. Ces résultats ont pris un écho particulier puisque de façon concomitante des équipes travaillant chez le mammifère ont pu mettre en évidence le rôle du PG comme étant la structure reconnu par les protéines Nod 1 et Nod 2 en publiant les structures minimums capable d’activer Nod 1 (le tripeptide) et Nod2 le muramyl dipeptide Nous nous sommes donc demandés quelle était le motif minimum reconnu par le système Imd chez le drosophile Meso-DAP : acide diaminopimélique : Gram négatif L-Lysine : Cocci Gram positif DAP déamidé et 3% de meso-DAP : Bacillus à Gram positif

11 Le rôle du DAP est moins important que dans le système NOD1
La première surprise est que la présence de l’acide diaminopimélique n’est ps aussi critique que dans le système nod1. Nous avons injecté du PG normal et du PG modofoié portant en troisème position des analogues structuraux de l’acide di aminopimélique et nous avons constaté que l’induction de la diptéricine n’atit pas modifié alors que dans le système Nod 1 le remplacement de cette AA par ces analogues abolit complètement la réponse Diaposuivante

12 Rôle important de l’extrémité anhydro
La digestion du PG par SltY mais pas par la muramidase produit des fragments qui activent la voie Imd Nous avons mesuré l(activité de la voie Imd après digestion avec différents types de muramidases qui coupe le PG après les acides muramiques en produisant des monomères GlucNacMurNac-peptides. Lorsque le PG est digéré avec de la muramidase standard. Les monomères produits n’active plus la voie Imd. De manière intéressante la digestion du PG avec l’enzyme SltY qui coupe le PG au même endroit que la précente mais en provoquant une transglycosylation de l’acide muramique produit des monomère qui active toujours la voie Imd suggérant le role important de l’extrémité anhydro dans la reconnaissance des PG de Gram négatif Rôle important de l’extrémité anhydro

13 Le GM(anh)-tétraDAP active la voie Imd
Pour avancer vers le motif minimum nous avons synthétisé un monomère anhydro constitué des deux sucres et des 4 premiers peptides et monitoré l’activation de la voie Imd. Ce monomère active bien la voie Imd moins bien cependant que le PG entier purifié de Paeruginosa. Le role partiel dans la reconnaisance du 3ième AA est confirmé puisque si on remplace dans ce monomère le DAP par la lysine, l’activation de la voie Imd n’est obtenu que pour les plus fortes concentation de monomères et restent plus faible que celle obtenu avec le monomère à DAP

14 Le GM(anh)-triDAP représente le motif minimum capable d’activer la voie Imd

15 Conclusion Le PG est la principale structure bactérienne reconnu par le système immunitaire de la drosophile La discrimination entre Gram négatif et Gram positif repose sur l’existence de formes spécifiques de PG Le GM(anh)-tripeptide à DAP est le motif mimimum capable d’activer la voie Imd Les éléments déterminant l’activation de la voie Imd sont : Le troisième AA : DAP L’existence d’une transglycosylation de l’acide muramique : importance potentielle dans la stéréospécificité de la reconnaissance

16 Remerciements CGM Bruno Lemaitre François Leulier Carolyn Stenbak
IBBMC-Orsay Claudine Parquet Martine Caroff Dominique Mengin-Lecreulx Université Ewha de Seoul Ji-Han Ryu Won-Jae Lee Besançon Emmanuel Samain Pierre Tiberghien Estelle Seilles

17 Similitudes moléculaires et fonctionnelles Origine évolutive commune.
Mammifères Drosophile Mammifères Voie TLR et de l’IL-1 Voie Toll Voie IMD Voie TNF-R1 Spatzle TNF-R1 TLRs ou IL1-R Hémolymphe Toll PGRP-LC DD DD DD MyD88 TIR TIR DmMyD88 TIR TIR ? dFADD TRADD DD DD DD DD DD DD Imd DD DD FADD RIP DD DD DD TAB2 IRAK Cytoplasme Tube Pelle D E D E Dredd TRAF2 D E D E ProCaspase-8 TAK1 TRAF6 dTAK1 TAB1 MEKK3 ? IKK IKK Caspase-8 IKK DmIKK IKK DmIKKß Caspase Effectrice (Caspase-3) Cactus IB ANK IB ANK Rel Rel Relish ANK Rel Rel Rel ANK ANK Rel Rel Rel ANK Rel ANK p105 Dorsal DIF Apoptose p50 RelA p50 RelA p105 Rel Rel Noyau Rel Rel Rel Rel Rel p50 RelA Dorsal DIF Relish p50 RelA B B B B B B B Cytokines Proinflamatoires Proteins Co-stimulatrices Peptides Antimicrobiens Genes de l’immunité Genes Anti-apoptotiques Similitudes moléculaires et fonctionnelles Origine évolutive commune.

18 La reconnaissance des micro-organismes
Concept des PAMP (« Pathogen Associated Molecular Pattern ») et PRR (« Pattern Recognition Receptor »). Janeway 1989. Les PAMPs: Composants présents sur l’enveloppe des agents infectieux mais absents des cellules de l’hôte. Ils sont relativement invariants et indispensables à la survie des pathogènes. Les PAMPS sont une signature de l’infection. Les PRRs sont des récepteurs de l’hôte sélectionnés au cours de l’évolution pour reconnaître certains PAMPs. Les PRRs permettent une discrimination du non-soi infectieux.