II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

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1 II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes
Jeudi 8 septembre 2005 II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

2 Généralités Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) Marquage fluorescent des molécules à suivre

3 Concentrations ioniques
Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide Indicateurs sensibles aux ions luminescents (aequorine de la méduse) fluorescents

4 Aequorine : protéine luminescente en fonction de [Ca++] libre entre 0,5 et 10 M
injection d'aequorine puis fécondation photo toutes les 4 secondes Libération de [Ca++] dans le cytoplasme Mais très faible intensité Fig 9-38

5 Fig 9-39 Cellule de Purkinje
Indicateur fluorescent sensible à [Ca++] (fura-2) [Ca++] intra cellulaire en fluorescence rouge : forte [Ca++] (dendrites) bleu : faible [Ca++] Fig 9-39

6 Autres indicateurs fluorescents
Autres ions

7 Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur
Anticorps Protéine cellulaire purifiée marquée Exemple tubuline

8 Jeudi 8 septembre 2005 Fig tubuline P572#2

9 Fig tubuline

10 Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une fonction
Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose

11 Quatre méthodes d'introduction de molécules dans la cellule
Microinjection Électroporation Vésiculation Projection à haute vitesse…

12 Fig 9-40 (AB)

13 Fig 9-40 (CD)

14 Molécules captives Synthèse d'une forme inactive de la molécule
Jeudi 8 septembre 2005 Molécules captives Synthèse d'une forme inactive de la molécule Introduction dans la cellule Activation à un temps et moment donné par un faisceau lumineux eg : molécules captives pour Ca++, AMPc, GTP, IP3 P572#3

15 Fig 9-41 Caged molecules La molécule X devient active après le flash d'UV

16 Application Molécules fluorescentes piégées
Grosse modification de la molécule qui doit rester active  grosse difficulté  Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules eg : tubuline

17 Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine Après 1,5 mn Après 2,5 mn Tubuline rhodamine (rouge) Dapi ADN (bleu) Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et invisible avant le rayon d'UV)

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22 Jeudi 8 septembre 2005 Desai,A1998

23 Jeudi 8 septembre 2005

24 Green Fluorescence Protein

25 Fig 9-43 GFP

26 GFP 3D

27 GFP GFP Topol

28 GFP mice

29 Fig 9-44 GFP tagging

30 Jeudi 8 septembre 2005 GFP An inhibitory neuron in a living slice culture of the neonatal mouse hippocampus, transfected with the gene for Green Fluorescent Protein

31 Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging

32 III - Culture cellulaire
Isolement Séparation (FACS) Culture primaire et secondaire Milieu de culture Lignée cellulaire Transformation Congélation Clone Hybride

33 Facs

34 Hybride cellulaire

35 Production AC monoclonaux

36 Culture SEM

37 Immuno gold en ME ME Immuno-gold

38 Pistage de molécules dans la cellule
Pulse-chase Patch-Clamp Molécules « piégées » Les anticorps immunofluorescence directe immunofluorescence indirecte

39 Fig 9-46

40 Fig 9-47 Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas Fig 9-47 Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse

41 Fig 9-48

42 IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules
Jeudi 8 septembre 2005 IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules Techniques biochimiques