V - Transport cytosol  reticulum endoplasmique

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1 V - Transport cytosol  reticulum endoplasmique
Jeudi 27 septembre 2007 V - Transport cytosol  reticulum endoplasmique

2 Schéma du routage

3 Le reticulum endoplasmique
Chez tous les eucaryotes Plus de la moitié des membranes de la cellule Membrane continue, lumière continue 10 % du volume de la cellule

4 Principaux rôles Synthèse des lipides et des protéines
Site de production de toutes les protéines transmembranaires et lipides des organites de la cellule RE, Golgi, Lysosomes, Endosomes, Vésicules sécrétoires, Membrane plasmique Lipides des membranes de mitochondries et peroxysomes (pas toutes) Protéines destinées à l'extérieur Protéines destinées à lumière de RE, Golgi, Lysosome passent par le RE

5 AC contre une protéine résidente du RE

6 Fig 12-35 AC contre une protéine résidente du RE
Cellule de plante vivante + protéine fluorescente Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-35

7 Jeudi 27 septembre 2007 Thiéry,G1983 Fig 1 Thiéry,G1983 Fig 1

8 Jeudi 27 septembre 2007 Thiéry,G1983 Fig 3 Thiéry,G1983 Fig 3

9 Jeudi 27 septembre 2007 Thiéry,G1983 Fig 4 Thiéry,G1983 Fig 4

10 Jeudi 27 septembre 2007 Thiéry,G1983 Fig 6 Thiéry,G1983 Fig 6

11 Jeudi 27 septembre 2007 Bergeron,M1981 Sch 1 Bergeron,M1981 Sch 1

12 Généralités Le RE capture les protéines à partir du cytosol
protéines transmembranaires : destinée RE ou autre (membrane plasmique, … , ) protéines solubles : destinée lumière d'un organite ou sécrétion Même signal de tri au départ dans le RE

13 Rappel : les deux types d'import
Post-traductionnel mitochondrie, noyau, peroxysomes Co-traductionnel RE pas de risque de repliement de la protéine avant son insertion  pas besoin de chaperones nécessité de fixer les ribosomes sur le RE  RE granulaire (REG)

14 RE granulaire en microscopie électronique
Jeudi 27 septembre 2007 RE granulaire en microscopie électronique

15 Les deux populations de ribosomes
Ribosomes liés : protéines transloquées dans le RE Ribosomes libres : toutes les autres protéines Ont la même structure Fonctionnent de la même façon La différence est la protéine qui est en train d'être synthétisée

16 Jeudi 27 septembre 2007 Le RE granulaire Fig 12-36

17 Polyribosomes attachés à la membrane du RE
Jeudi 27 septembre 2007

18 Jeudi 27 septembre 2007 Il n'y a pas de signal RE Fig 12-37(A)

19 Jeudi 27 septembre 2007 Le signal RE de la nouvelle chaîne dirige le ribosome vers la membrane du RE Fig 12-37(B)

20 Le RE lisse C'est du RE sans ribosomes Toutes les cellules en ont
élément de transition d'où bourgeonnent les vésicules en continuité avec le REG Très développé dans les cellules qui ont un métabolisme lipidique important eg : les cellules qui fabriquent des hormones stéroïdes à partir du cholestérol

21 REL abondant dans une cellule de Leydig
Fig 12-38(A)

22 Reconstruction 3-D de REG et REL dans un hépatocyte
Fig 12-38(B)

23 Rôle de REL dans le métabolisme des lipides
Hépatocyte : lieu de production des particules de lipoprotéines (transporteurs des lipides) Enzymes de synthèse localisées dans la membrane du REL Détoxification cytochrome P450 (solubilise des toxiques) phénobarbital  doublement de la surface du REL en quelques jours puis résorption par autophagocytose

24 Autres rôles du REL Séquestration du calcium
Beaucoup de Calcium Binding protein Exemple : le reticulum sarcoplasmique Ca++ATPase qui pompe le Ca++ vers la lumière

25 Microsomes Origine technique de préparation de laboratoire
Petites vésicules fermées Granuleuses ou lisses Proviennent de toutes les membranes de la cellule Sont fonctionnels (synthèse de protéines, glycosylation des protéines, captage du Ca++, synthèse de lipides)

26 Origine des microsomes
Lisses : membrane plasmique, Golgi, endosomes, mitochondries … exception : hépatocyte où REL  microsomes lisses Granulaire : RER uniquement

27 Jeudi 27 septembre 2007 Isolement de microsomes rugueux et lisses à partir du reticulum endoplasmique Fig 12-39(A)

28 Jeudi 27 septembre 2007 Microsomes rugueux Fig 12-39(B)

29 Reticulum endoplasmique rugueux et microsomes rugueux

30 Comparaison REG REL Continuité de membrane Continuité de lumière
Grande similitude de protéines Plus de 20 protéines en plus dans le REG  il existe une séparation entre les deux protéines de liaison des ribosomes à la membrane protéines qui donnent la forme aplatie au REG interactions entre les protéines spécifiques ? ou réseau sur une des deux faces

31 Découverte du signal peptide
Au début des années '70 Protéines sécrétées ARNm + ribosomes (sans microsomes) in vitro  protéines plus longue que la protéine normale (leader peptide en plus) ARNm + ribosomes + microsomes granuleux  protéines de taille correcte  hypothèse du signal : le leader peptide sert de signal pour diriger la protéine vers le RE clivage par une signal peptidase dans la membrane du RE avant la fin de la synthèse

32 Le clivage a lieu dans la lumière du RE
Synthèse de la protéine sans microsome + protéase  dégadation de la protéine Synthèse de la protéine avec microsome + protéase  pas de dégradation de la protéine (protection par la membrane du microsome) Protéines sans signal ne sont pas importées dans les microsomes  dégradation

33 Hypothèse du signal S'applique :
plante + animal + membrane plasmique de la bactérie mitochondrie, chloroplaste, peroxysome protéines sécrétées en fait toutes les protéines fabriquées par les ribosomes liés Confirmée par les résultats à partir de protéines de fusion

34 Fig 12-40 Hypothèse originale du signal peptide
Jeudi 27 septembre 2007 Hypothèse originale du signal peptide Fig 12-40

35 Guidage de la séquence signal RE
Signal Recognition Particle (SRP) navette entre membrane du RE et cytosol se lie à la séquence signal Récepteur de SRP dans la membrane du RE

36 Signal Recognition Particle
Jeudi 27 septembre 2007 Signal Recognition Particle Très conservé 11S RNP 6 chaînes polypeptidiques différentes : 72, 68, 54, 19, 14, 9 SRP 68/72,19, 54 : liaison au centre = domaine S 1 molécule d’ARN (300 nucléotides appelé 7SL RNA)

37 Anatomie fonctionnelle de SRP
2 extrémités liaison au ribosome et blocage de la traduction liaison à la séquence signal RE du polypeptide en élongation 3 sites de reconnaissance Ribosome Séquence du signal RE Récepteur de SRP

38 Signal Recognition Particle (SRP)
Jeudi 27 septembre 2007 Signal Recognition Particle (SRP) bactérie Fig 12-41

39 Liaison au signal RE du polypeptide en élongation
Poche bordée d’acides aminés hydrophobes (riche en méthionine  domaine M) donc très flexible  grande flexibilité pour s'adapter à beaucoup de types de protéines

40 Séquence signal du Reticulum endoplasmique
Grande variation dans la séquence des acides aminés 8 ou plus acides aminés non polaires à leur centre Peut être accepté par la poche hydrophobe de SRP

41 Wild,K2002 fig1 Chez eucaryote SRP 54 2 domaines
Alu : SRP 14 et 9 S : SRP 72/68 et 19 54 SRP 54 Domaine M(ethionine-rich) Domaine N(terminal) G(TPase) Jeudi 27 septembre 2007 Wild,K2002 fig1 Fig. 1. Schematic representations of SRPs from the three kingdoms of life [5]. (a) The eukaryotic SRP comprises six polypeptides bound to the SRP RNA and is divided into the Alu and Sdomains. (b) The archaeal SRP has a similar architecture, but retains only proteins SRP19 and SRP54. (c) The eubacterial SRP generally is a minimal particle that only includes the SRP54 homologue, Ffh, bound to the most conserved part of the SRP RNA. However, in some Gram-positive bacteria, such as B. subtilis, the Alu domain is retained, with the dimeric HBsu protein replacing SRP9/14. SRP54/Ffh comprises the C-terminal M-domain, which binds the RNA and the signal peptide, and the NG domain. Ffh = homologue de SRP 54

42 Crystal structures of three protein–RNA subcomplexes from the SRP
Jeudi 27 septembre 2007 Crystal structures of three protein–RNA subcomplexes from the SRP Wild,K2002 fig2 Fig. 2. Crystal structures of three protein–RNA subcomplexes from the SRP. Highly conserved nucleotides that are important for protein binding are highlighted in pink. (a) The 5' domain of the human Alu domain [6] at 3.2 Å resolution, consisting of the SRP9/14 heterodimer and a 50-nucleotide RNA fragment. Note the three Watson–Crick tertiary loop–loop base pairs at the top of the diagram. (b)The early S-domain assembly complex between human SRP19 and 29 nucleotides of helix 6 at 1.8 Å resolution [8]. (c)Part of the phylogenetically conserved core of SRP, including the E. coli Ffh M-domain bound to 49 nucleotides of domain IV (helix 8) of 4.5S RNA, as determined at 1.8 Å resolution [7 and 25]. Under each structure, a schematic diagram shows the context of the crystallised RNA (in orange) within the complete SRP RNA. Figure prepared with RIBBONS [42].

43 Jeudi 27 septembre 2007 Fold of SRP RNA-binding proteins compared with common RNA-binding domains Wild,K2002 fig3 Fig. 3. The fold of SRP RNA-binding proteins compared with common RNA-binding domains. SRP19 has a similar topology to the KH domain [27], with an antiparallel three-stranded sheet (1-3-2 order of the strands) packed against two helices on one side. In the RNA-recognition motif (RRM) [43], the same topology is extended by a fourth strand. SRP9 [10] and SRP14 (not shown) have an topology (1-2-3 order of the strands) and resemble the double stranded RNA binding domain (dsRBD) [44]. Although SRP9, SRP14 and SRP19 share similar topologies with common RNA- binding motifs, the position of the helices, the organisation and length of the loop regions, and the manner of RNA binding are unique to the SRP proteins. The M-domain of Thermus aquaticus Ffh is all -helical and has no similarities with the other RNA-binding domains [45]; it is highly homologous to the human SRP54 M-domain [23]. Figure created with MOLSCRIPT [46] and Raster3D [47].

44 Wild,K2002 fig4 Structure and assembly of the Alu domain of the SRP
Jeudi 27 septembre 2007 H. sapiens S.pombe B. subtilis Wild,K2002 fig4 Proposed hierarchical assembly pathway for the mammalian Alu RNP Fig. 4. Structure and assembly of the Alu domain of the SRP. (a)Secondary structure of Alu RNA from H. sapiens. The 5'domain consists of helix/loop 1 (light grey) connected to helix/loop 2 (black) via a -junction on one side and tertiary loop–loop contacts on the other. Within the - junction, the light grey corner bar indicates stacked base pairs and the thin blue line represents the conserved U-turn. The 5' domain is flexibly linked (black arrow) to the Alu RNA 3' domain (helix 3, dark grey), which has an asymmetric internal loop. Phylogenetically conserved nucleotides are in magenta and structurally maintained elements are in blue. The connection to the S-domain is indicated by grey dots. Circles around nucleotides indicate observed tertiary loop–loop interactions. Proposed secondary structure of (b)the S.pombe SRP RNA Alu domain [5] and (c) the B. subtilis SRP RNA Alu domain [5]. Colours and annotations as in (a). (d)Proposed hierarchical assembly pathway for the mammalian Alu RNP [11]. In a first step, the preformed heterodimer of SRP9 (red) and SRP14 (green, with the important C-terminal tail dotted in cyan) first binds to and organises the Alu RNA 5' domain. In a second step, the Alu RNA 3'domain flips by up to 180° and is clamped against the 5' Alu RNP. The RNA backbone is traced in yellow (orange where structurally conserved).

45 The structure of the human SRP19–helix 6 complex
(a) Overall structure Jeudi 27 septembre 2007 (b) A comparison of the GNAR and GNRA tetraloops Wild,K2002 fig5 Fig. 5. The structure of the human SRP19–helix 6 complex. (a) Overall structure. The RNA nucleotides are reduced to colour-coded cylinders. The bases of the GGAG tetraloop are highlighted in orange, with the exception of the invariant A149, which is shown in red. Non-Watson–Crick base pairs of helix 6 are drawn in pink. SRP19 is coloured according to its secondary structure. (b) A comparison of the GNAR and GNRA tetraloops. Overlay of the GNAR (GGAG) tetraloop that caps human 7SL RNA helix 6 (blue, numbered), including relevant water molecules, with the GNRA- type tetraloop (GAAA) taken from the E. coli 4.5S RNA domain IV (green) [7]. Notable differences are indicated by red arrows. Figure generated with RIBBONS [42]. (c) Protein–RNA interactions in the human SRP19–helix 6 complex, showing the hydrogen-bonding network around the first (G147) and fourth (G150) bases of the GGAG tetraloop, and the interactions of the strictly conserved 31EGRR fingerprint with the widened major groove. The fingerprint loop region is stabilised by numerous hydrogen bonds to the protein backbone. Whereas Arg33 is in direct contact with the RNA, the interactions between Arg34 and the RNA are water mediated. All donor and acceptor positions of Arg33 and Arg34 are occupied. The saturation of the hydrogen-bonding capacities of a water molecule bound to N1 of G147 adds to the specific binding. For Tyr22 and Tyr68, only the exocyclic hydroxyl groups are shown. Figure prepared using MOLSCRIPT [46] and Raster3D [47]. The structure of the human SRP19–helix 6 complex

46 Towards the structure of the mammalian SRP
Jeudi 27 septembre 2007 Towards the structure of the mammalian SRP Wild,K2002 fig6 Fig. 6. Towards the structure of the mammalian SRP. The known crystal structures of SRP components have been assembled and schematically placed in the envelope of an electron microscopy image obtained for the mammalian SRP (top left) [18]. The model of the complete Alu domain is based on crystallographic [6] and biochemical studies [11]. The rationale for the relative orientation between the SRP19–helix 6 complex and the Ffh M-domain–domain IV (helix8) structure is based on crystallographic [8] and biochemical footprint [36 and 37] data. The positions of SRP68/72 and the Ffh NG domain with respect to the other structures are hypothetical; SRP68/72 could equally well be partially located in the central domain in the electron microscopy image. The organisation of the central part of the SRP RNA is unknown (the missing RNA of about 170 nucleotides is sketched as a dashed double line), as is the exact position of the Alu and S-domain boundary.

47 Stroud,RM1999 Fig 2 7S RNA 4.5S RNA Stroud,RM1999 Fig 2
Jeudi 27 septembre 2007 7S RNA 4.5S RNA Stroud,RM1999 Fig 2 Stroud,RM1999 Fig 2

48 Stroud,RM1999Fig 3 + - Domaine M(éthionine rich) de Ffh
Jeudi 27 septembre 2007 + Stroud,RM1999Fig 3 Stroud,RM1999 Fig 3 A surface representation of the Ffh M domain colored according to local electrostatic surface potential; blue is positive and red is negative. The positively charged surface provides the binding surface for RNA. Three amino acids at the helix-turn-helix junction of helices a3 and a4, R387, G391 and G393, can not be mutated without a large loss of RNA binding. The generally positively charged surface and several positive residues that generate the surface, including R386 and R387, are conserved in SRPs. The location of the hydrophobic groove, the most probable site for binding the hydrophobic portion of the signal sequence, and the site of interaction with RNA are indicated. -

49 Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE
Liaison de SRP à la séquence signal Arrêt de la synthèse protéique Fixation du ribosome à la membrane du réticulum endoplasmique →pas de libération prématurée (lysosome) Fixation du complexe SRP-ribosome au récepteur du SRP Rapprochement du complexe vers un translocateur Libération de SRP de son récepteur Translocation de la chaîne protéique naissante à travers la membrane du réticulum endoplasmique

50 Jeudi 27 septembre 2007 Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12-42(A)

51 Jeudi 27 septembre 2007 Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12-42(A)

52 Jeudi 27 septembre 2007 Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12-42(B)

53 Résumé : les 5 acteurs Cytosol RE SRP
Séquence signal RE de la chaîne naissante Ribosome RE SRP-r Translocateur

54 Stroud,RM1999Fig 1 Aspect énergétique : GTP Jeudi 27 septembre 2007
Stroud,RM1999 Fig 1 A schematic of the process of the signal-targeted insertion of signal-sequence-containing secretory or membrane proteins, as currently determined. The ribosome, shown at the top, is normally protected from association with the translocating complex in the target membrane by the attachment of an NAC (not shown). SRP can bind to signal sequences and competes with NAC, protecting the translocon-attachment site (‘M-site’) until SRP meets its receptor. SRP binding leads to a pause in translation. Binding of the ribosome–SRP complex to the SR uncovers the translocon-binding site on the ribosome and initiates threading of the signal sequence and the following protein. It also activates the GTPase activity of both SRP and SR. T represents bound GTP. It is not known, however, when GTP binding takes place. It may occur upon SRP binding to the ribosome–signal sequence complex, upon attachment of the SRP to the SR or upon formation of the seal between the ribosome and the translocon. Hydrolysis of GTP to GDP releases the SRP–SR affinity. A membrane-bound signal peptidase cleaves the signal sequence to release the N terminus of the mature protein.

55 Le translocateur : Sec61 Pore aqueux 3 à 4 complexes protéiques
Chaque complexes = protéines transmembranaires Structure en beignet Alignement du translocateur avec le tunnel de la grosse sous - unité du ribosome Puis "soudure" translocateur - ribosome

56 Jeudi 27 septembre 2007 Science, Vol 278, Issue 5346, , 19 December Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome-Sec61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim FrankThree-dimensional reconstruction of the ribosome-Sec61 complex in a surface representation Fig. 3. Three-dimensional reconstruction of the ribosome-Sec61 complex in a surface representation. (A) Front view, with the Sec61 oligomer shown in red. (B) Front view, with the Sec61 oligomer shown as transparent, to demonstrate the alignment of the Sec61 oligomer pore with the tunnel exit of the large ribosomal subunit indicated with the yellow arrow. (C) Side view, with the Sec61 oligomer shown in red. (D) Ribosome-Sec61 complex lying in the same orientation as in (C), cut along a plane that cross sections the pore of the Sec61 oligomer and the ribosome tunnel. The arrow indicates the stem connecting the ribosome with the Sec61 oligomer; the space between the two ribosomal subunits is indicated by an asterisk. The ribosomal tunnel and its alignment with the Sec61 pore is indicated by a broken yellow line. Scale bar, 100 Å.

57 Jeudi 27 septembre 2007 Three closeup views of the Sec61 oligomer. (A) Surface facing the ribosome. There is a vestibule (diameter of 35 Å) formed by the funnel-like structure and the pore (diameter of 15 Å). (B) Surface facing away from the ribosome. (C) View of the side opposite the attachment site. The ribosome would be located underneath the channel. The wall opposite the attachment site is thinner and more irregular. Arrows indicate the attachment site. Scale bar, 50 Å. Science, Vol 278, Issue 5346, , 19 December Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome-Sec61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim Frank Figure 4. Three closeup views of the Sec61 oligomer. (A) Surface facing the ribosome. There is a vestibule (diameter of 35 Å) formed by the funnel-like structure and the pore (diameter of 15 Å). (B) Surface facing away from the ribosome. (C) View of the side opposite the attachment site. The ribosome would be located underneath the channel. The wall opposite the attachment site is thinner and more irregular. Arrows indicate the attachment site. Scale bar, 50 Å.

58 Fig 12-43 "Soudure" entre le ribosome et le translocateur (Sec61)
A - Vue latérale ribosome - Sec61 B - Vue du cytosol C - Schéma Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-43

59 Jeudi 27 septembre 2007 Mise en évidence de la soudure étanche entre ribosome et translocateur (Sec61) Fig 12-44 Quenched = éteint

60 Le pore aqueux Continuum entre le tunnel du ribosome et le canal aqueux du translocateur Le pore n'est pas ouvert en permanence : se referme pour éviter la fuite du Ca++ du RE vers le cytosol  Structure dynamique C'est la séquence signal qui ouvre le pore au bout d'un certain temps d'alongement de la chaîne  2 reconnaissances de la séquence signal SRP translocateur (pour ouvrir le pore)

61 Le transport n'est pas toujours co-traductionnel
Levure, paroi bactérienne ( RE)

62 Fig 12-45(A) Translocation co-traductionnelle
Jeudi 27 septembre 2007 Translocation co-traductionnelle Fig 12-45(A) Pas de nécessité d'énergie (pour l'importation)

63 Translocation post traductionnelle
Sec A que dans les bactéries pas de Sec61 moteur protéique c'est une ATPase fonctionne comme un piston Bip (Binding protein) c'est une proteine chaperonne hsp70 se fixe sur la chaîne en émergence grâce à d'autres Sec fixées à Sec61 cycle de liaison et libération  translocation

64 Fig 12-45(BC) Translocation post-traductionnelle
Jeudi 27 septembre 2007 Des Sec supplémentaires déposent des molécules de Bip sur la chaîne émergeante. Liaison et libération de Bip tirent sur la chaîne (comme le cliquet dans la mitochondrie). Intervention de Sec A ATPase (exclusivement dans les bactéries) (piston) Fig 12-45(BC) Translocation post-traductionnelle

65 La signal peptidase Clive la séquence signal dans la lumière du RE
Nécessite un site de reconnaissance différent de la séquence signal Les séquences signal RE situées à l'intérieur du polypeptide ne sont jamais clivées (pas de site de reconnaissance pour la signal peptidase) Mais servent à retenir les protéines transmembranaires

66 Les deux fonctions de la séquence signal
Guide la protéine vers le reticulum endoplasmique Sert de signal de transfert "start" pour ouvrir le pore (start transfert signal)

67 La séquence signal Contact avec Sec61 ET les lipides de la membrane
Il y a ouverture latérale du pore pour libérer la séquence signal clivée  Il y a deux ouvertures dans le translocateur (pore + sortie latérale)

68 Translocation dans le réticulum endoplasmique
Protéines solubles Protéines membranaires

69 Fig 12-46 1 - Translocation d'une protéine soluble
Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-46

70 2 - Trois modèles d'insertion d'une protéine transmembranaire à un passage dans la membrane du RE

71 Modèle 1 idem protéine soluble mais segment hydrophobe en plus…
donc présence d'une séquence signal qui est le start transfert signal ( autres modèles) … qui bloque le transfert (signal d'arrêt de transfert) (stop transfert sequence) qui ancre la protéine dans la membrane une fois le signal start libéré Extrémité -N luminale

72 Protéine transmembranaire à un passage : modèle 1 (-N luminal)
Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-47

73 Modèle 2 La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : c'est le segment de protéine suivant la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du RE Extrémité -N cytosolique

74 Protéine transmembranaire à un passage : modèle 2 (-N cytosolique)
Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-48(A)

75 Modèle 3 La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : c’est le segment de protéine précédent la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du réticulum endoplasmique Extrémité –N terminale

76 Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-48(B) Protéine transmembranaire à un passage : modèle 3 (-N luminal)

77 Insertion d'une protéine transmembranaire à deux passages dans la membrane du RE
Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop

78 Jeudi 27 septembre 2007 Protéine transmembranaire à deux passages : (-N et -C cytosoliques) Fig 12-49

79 Insertion d'une protéine transmembranaire à plusieurs passages dans la membrane du RE
Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop Suivi d'un signal de transfert start… Suivi d'un signal de transfert stop… Suivi d'un signal de transfert start...

80 Fig 12-50 Insertion de la rhodopsine dans la membrane du RE
Jeudi 27 septembre 2007 Insertion de la rhodopsine dans la membrane du RE Fig 12-50

81 Établissement d'un cadre de lecture
La SRP balaie la chaîne naissante de -N vers -C SRP considère la première séquence hydrophobe comme signal start Puis alternance de stop - start

82 Asymétrie des membranes
SRP fixe ainsi l'asymétrie des membranes Cette asymétrie est conservée pendant les phénomènes de bourgeonnement et fusion Le mode d'insertion d'une nouvelle protéine dans la membrane du RE détermine l'orientation de cette protéine dans toutes les autres membranes L'asymétrie est inhérente au processus d'insertion dans la membrane et non pas à la protéine elle-même

83 Rôle de la lumière du RE dans la qualité des protéines
Présence de protéines résidentes du RE contenant un signal de rétention RE : -Lys-Asp-Glu-Leu-COO- Aide à l'assemblage et repliement correct des protéines Exemple 1 : protein disulfide isomerase (PDI) Exemple 2 : binding protein (BiP)

84 Exemple 1 : Protein Disulfide Isomerase (PDI)
catalyse l'oxydation des – SH de cystéines en S – S le cytosol a un environnement réducteur ( excès d'électrons  – SH prédominant)

85 Exemple 2 : Binding Protein (BiP)
Jeudi 27 septembre 2007 Exemple 2 : Binding Protein (BiP) BiP reconnaît les protéines mal repliées Se comporte comme la famille des hsp 70 pour l'importation dans les mitochondries Capable d'hydrolyser ATP se fixe sur les séquences d'acides aminés qui devraient être soit enfouies soit nécessaires à l'assemblage de la chaîne eg alternance d'acides aminés hydrophobes et hydrophiles qui devraient faire des plis  Aide à maintenir de telles protéines dans le RE

86 Nat Struct Biol : Albanèse,V2002(fig1)
Jeudi 27 septembre 2007 Rôle du site de sortie du ribosome dans le repliement des protéines chez les bactéries et dans la sécrétion protéique des eucaryotes Nat Struct Biol : Albanèse,V2002(fig1) Nat Struct Biol, October 2002,Volume 9, Number 10 pp Where chaperones and nascent polypeptides meet. Véronique Albanèse

87 Glycosylation dans le réticulum endoplasmique
Une des principales fonctions du réticulum endoplasmique  glycoprotéines Presque toutes les protéines fabriquées dans le RE solubles et membranaires sont glycosylées Les protéines du cytosol le sont très peu Glycosylation dans le Golgi (plus rare) O lié sur le OH d'une sérine ou thréonine ou hydroxylysine (cf. infra)

88 Jeudi 27 septembre 2007 Précurseur oligosaccharidique ajouté à presque toutes les protéines du réticulum endoplasmique granulaire Fig 12-51

89 Fig 12-52 Glycosylation dans le réticulum endoplasmique
Jeudi 27 septembre 2007 Glycosylation dans le réticulum endoplasmique Intervention de oligosaccharyl-transférase a lieu pendant la synthèse de la protéine Le plus souvent N lié sur une asparagine Fig 12-52

90 Jeudi 27 septembre 2007 Intervention du dolichol Fig 12-53

91 Importance de la glycosylation
Certaines protéines ont besoin d'être N-glycosylées pour se replier correctement Intervention de deux protéines chaperone du RE calnexine calréticuline

92 Calnexine et calréticuline
Nécessitent du Ca++ pour leur activité Sont des lectines Se lient aux oligosaccharides des protéines mal repliées et les retiennent dans la lumière du RE Empêche l'agrégation des protéines mal repliées Reconnaissent les oligosaccharides N-liés qui ont un simple glucose terminal donc interviennent après la suppression de 2 des 3 glucoses de l'oligosaccharide Calnexine : membrane du RE Calréticuline : lumière du RE

93 Comment calnexine et calréticuline reconnaissent-elles une protéine bien repliée d'une protéine insuffisamment repliée ? Intervention d'une autre enzyme du RE : une glycosyl-transférase qui ajoute toujours un glucose aux oligosaccharides qui ont perdu leur dernier glucose et qui sont attachés à une protéine mal repliée  Cycle glucosidase (ablation) / glycosyl transférase (addition)

94 Rôle de la glycosylation N-liée dans le maintien du repliement correct des protéines
Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-54 #13p704

95 Dislocation des protéines du RE vers le cytosol
Jeudi 27 septembre 2007 Dislocation des protéines du RE vers le cytosol Beaucoup de protéines arrivent dans la lumière du RE mal ou pas repliées Elles retournent dans le cytosol par le même Sec61 (rétrotranslocation appelée dislocation) où elles sont dégradées Comment sont-elles reconnues ? Un fois dans le cytosol, les oligosaccharides sont retirés par une glycannase Puis ubiquitinylation  Dégradation dans les protéasomes #14p704

96 Fig 12-55 Retour des protéines du RE mal repliées vers le cytosol
Même sort pour protéines solubles et membranaires Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-55 Intervention de protéines accessoires associées au translocateur pour fonctionner dans les deux sens

97 Réponse à une augmentation de protéines mal repliées
Si  protéines mal repliées Dans le cytosol  chaperones cytosoliques Dans le RE,  de la transcription des gènes qui codent pour les chaperones du RE La voie de signalisation vers le noyau est bien connue chez la levure… Exemple de régulation par épissage d'un ARN messager (!)

98 Jeudi 27 septembre 2007 Fig 12-56(A) Réponse chez la levure à une augmentation de protéines mal repliées

99 Ancrage d'un GPI (Glycosyl Phosphatidyl Innositol) à une protéine membranaire
Dans le cytosol il y a addition de chaînes d'acide gras ou de prényl à des protéines pour qu'elles deviennent membranaires idem pour les protéines du RE : liaison d'un GPI à la protéine qui deviendra membranaire Une fois dans la membrane plasmique, pourra être libérée facilement par une phospholipase

100 Fig 12-57 Attache d'un GPI à une protéine dans le RE
Jeudi 27 septembre 2007 Attache d'un GPI à une protéine dans le RE Fig 12-57

101 Rôle du réticulum endoplasmique dans la synthèse des lipides membranaires
Le RE synthétise presque tous les lipides des membranes (phospholipides, cholestérol... ) La synthèse a lieu dans le feuillet cytosolique de la membrane du RE idem pour PC (=lécithine), PE, PS et PI Action d'une scramblase pour équilibrer les deux feuillets (flip-flop normalement rare) scramblase : non spécifique (équilibre quantitatif) flippase : spécifique (maintien de l'asymétrie)

102 Fig 12-58(A) Synthèse de la phosphatidyl choline (PC)
Jeudi 27 septembre 2007 Synthèse de la phosphatidyl choline (PC) Fig 12-58(A)

103 Fig 12-58(B) Synthèse de la phosphatidyl choline (PC)
Jeudi 27 septembre 2007 Synthèse de la phosphatidyl choline (PC) Fig 12-58(B)

104 Jeudi 27 septembre 2007 Membrane du RE Rôle des translocateurs phospholipidiques : la scramblase Fig 12-59(A)

105 Fig 12-59(B) Membrane plasmique
Jeudi 27 septembre 2007 Membrane plasmique Rôle des translocateurs phospholipidiques : flippase ( PS et PE vers la face cytosolique) Fig 12-59(B)

106 Autres lipides membranaires
Céramide  glycolipides et sphingomyéline dans le Golgi Autres membranes

107 Les deux systèmes de membrane
Membrane plasmique, RE, Golgi, Lysosomes, endosomes, vésicules : échange des lipides et protéines (trafic membranaire) Mitochondries, peroxysomes (?) sont exclus de ce système protéines : importées du cytosol lipides : à importer du RE directement ou indirectement  protéines d'échange des phospholipides

108 Protéines d'échange des phospholipides
Transporteurs solubles de lipides Extraction suivie de diffusion Transportent une molécule de phospholipide à la fois Se fait d'une membrane riche vers une membrane pauvre

109 Fig 12-60 Protéines d'échange des phospholipides
Jeudi 27 septembre 2007 Protéines d'échange des phospholipides Équilibrage des deux feuillets ? Membrane interne de la mitochondrie ? Fig 12-60

110 Stroud,RM1999 Fig 4 Signal sequence recognition and protein targeting
Jeudi 27 septembre 2007 Signal sequence recognition and protein targeting Stroud,RM1999 Fig 4 Stroud,RM1999 Fig 4 The NMR structure of the 43-nucleotide, most highly conserved domain IV of 4.5S RNA shows that a symmetric pair of three mismatched bases makes unusual cross-strand hydrogen bonds, but does not break the overall helical structure, near the top of the image. An asymmetric mismatched pair of four bases (ACCA) near the 5¢ end are opposite one base (A67), leading to the formation of a unique, flexibly hinged structure. The hinge structure presents a ledge with access to the unpaired bases in the loop. The results of chemical protection from modification by Ffh binding are indicated in red for strongly protected and green for less-strongly protected. Protection from hydroxyl radicals (blue) or double-stranded RNAse at hosphates shown in red indicates regions of RNA that are involved in the interface with Ffh.

111 Stroud,RM1999 Fig 5 Signal sequence recognition and protein targeting
Jeudi 27 septembre 2007 Signal sequence recognition and protein targeting Stroud,RM1999 Fig 5 Nucleotide binding evokes hinged movement of the N and G domains of Ffh, which interact through a conserved interface. The interface is formed between a loop (consensus sequence ALLEADV at residues 37–43) at the end of the second helix in the N domain (left of the figure) and a loop in the G domain (consensus sequence DARGG at residues 250–254). This loop immediately follows D248, which forms two hydrogen bonds with the guanine base of the nucleotide, and leads into the hinge helix a4. Upon binding GDP and then Mg 2+ –GDP, D248 and loop residues 270–279 move in to capture the nucleotide. The N domain follows, progressively hinging downwards in the figure. The magnitude of the structural shifts is indicated using color gradients that range from blue (< 0.01 Å) to yellow (2.5 Å). The core G domain remains relatively unchanged. This eems to be especially true of the IBD domain, to the right side of the figure, suggesting that the N domain, rather than the IBD domain, may provide the route for signaling between nucleotide binding and affector or effector functions. Stroud,RM1999 Fig 5