Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA) Alain A

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1 Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA) Alain A
Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA) Alain A. Schweitzer, PhD PCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle GMP, Paris, Février 2004

2 Sommaire La méthode d’Ullberg Détection de la radioactivité
Définitions Historique La méthode d’Ullberg Détection de la radioactivité Quantification des autoradiogrammes Interprétation des résultats Principales applications Conclusions GMP, Paris, Février 2004

3 Définitions Ensemble de méthodes “photographiques” permettant la détection et la localisation spatiale/géographique d’éléments radioactifs présents dans un échantillon solide Macro- vs. Microautoradiographie QWBAR, QWBAL et DNC GMP, Paris, Février 2004

4 Historique (autoradiographie)
1897 (Niepce de St Victor): er “autoradiogramme” (sels d’uranium) GMP, Paris, Février 2004

5 Historique (autoradiographie, suite)
1904 (London) : ère application biologique de l’autoradiographie GMP, Paris, Février 2004

6 Historique (autoradiographie, suite)
1953: 1ère utilisation des particules β- (Dziewiatkovski) 1954: WBAR des substances diffusibles (Ullberg) 1963: 1ère tentative de quantification WBAR (Kutzim) 1975: Brévet (USA) des écrans-phosphore (Luckey) 1983: Comptage Nucléaire Direct (Jeavons) 1989: Autoradioluminographie (Miyahara) GMP, Paris, Février 2004

7 Historique (coupes d‘animaux entiers)
1947 (Libby) : scie à ruban, 2-3 mm, souris 1954 (Ullberg) : microtome, 100 µm, en chambre froide 1959 (Cohen et al.) : microtome à congélation (CO2) 1961 (Pellerin) : rape/fraise d’atelier, seulement 1 WBA 1962 (Martin et al.) : disque abrasif/perceuse, souris 1966 (Kalberer) : scie circulaire, 2-4 mm, chat, singe 1977 (Ullberg) : cryomicrotome, méthode actuelle GMP, Paris, Février 2004

8 Historique (méthode de Kalberer, 1966)
GMP, Paris, Février 2004

9 Congélation Enrobage “Trimming” Obtention des coupes Cryodessication
La méthode d‘Ullberg Congélation Enrobage “Trimming” Obtention des coupes Cryodessication GMP, Paris, Février 2004

10 Congélation des animaux
Azote liquide ?? Hexane-CO2 solide Souris min (<pour males and fng <25 g) Rat min (<pour males and fng <180 g) Lapin 2-4 h (<pour males and fng <2 kg) Singe 2-4 h (<pour males and fng <1.5 kg) Congélation rapide = pas de diffusion Curtis et al., Whole-Body Autoradiography. Academic Press, Inc., London) GMP, Paris, Février 2004

11 Enrobage GMP, Paris, Février 2004

12 Le Leica CM3600 PLC GMP, Paris, Février 2004

13 Le Leica CM3600 PLC GMP, Paris, Février 2004

14 Atteinte du niveau de coupe (“trimming”)
GMP, Paris, Février 2004

15 Obtention des coupes GMP, Paris, Février 2004

16 La coupe GMP, Paris, Février 2004

17 Détection de la radioactivité
Autoradiographie, à l‘aide de films (QWBAR) Autoradioluminographie/imagerie phosphore, à l‘aide d‘écrans-phosphore (QWBAL) Comptage nucléaire direct, dans le compteur GMP, Paris, Février 2004

18 QWBA / Principe QWBAR GMP, Paris, Février 2004

19 QWBA / Principe QWBAL GMP, Paris, Février 2004

20 QWBAL / exemple de balayage
GMP, Paris, Février 2004

21 QWBAL / exemple de balayage /Cyclone
GMP, Paris, Février 2004

22 QWBAL / exemple de balayage /BAS5000
GMP, Paris, Février 2004

23 QWBA / principe DNC / MICAD
GMP, Paris, Février 2004

24 QWBA / principe DNC /BetaImager 2000
GMP, Paris, Février 2004

25 QWBA / comparaison QWBAL et DNC
GMP, Paris, Février 2004

26 QWBA / durées QWBAR, QWBAL et DNC
GMP, Paris, Février 2004

27 QWBA / analyse en temps réel DNC
GMP, Paris, Février 2004

28 QWBA / analyse en temps réel DNC
GMP, Paris, Février 2004

29 QWBA / comparaison QWBAL et DNC
GMP, Paris, Février 2004

30 QWBA : Résolution “film”
GMP, Paris, Février 2004

31 QWBA : Résolution PhosphorImager
GMP, Paris, Février 2004

32 QWBA : Résolution BetaImager (3H, 14C)
GMP, Paris, Février 2004

33 QWBA / DNC (résolution µ-Imager®)
GMP, Paris, Février 2004

34 QWBA : Quantification GMP, Paris, Février 2004

35 Quantification Historique
GMP, Paris, Février 2004

36 Quantification Historique
Kutzim (1963) 1ère quantification des WBA par densitometrie GMP, Paris, Février 2004

37 Quantification auto-absorption tissulaire ?
caractéristiques des coupes ? conditions d‘exposition ? GMP, Paris, Février 2004

38 Quantification : auto-absorption tissulaire
Détecteur Coupe (40 µm) d‘un rat non traité Source radioactive homogène GMP, Paris, Février 2004

39 Quantification Tissus Absorbance moyenne ± SD
Foie Moelle osseuse Cerveau Rate Coeur Rein Glande salivaire Vesicule séminale Poumon Surrénale SANG Muscle Testicule/epididyme Os minéral Tissue adipeux Globe oculaire GMP, Paris, Février 2004

40 Quantification : “efficacité relative” DNC
GMP, Paris, Février 2004

41 Quantification : épaisseur des coupes
GMP, Paris, Février 2004

42 Quantification : conditions d’exposition
GMP, Paris, Février 2004

43 Quantification : conclusions
Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire ▼ Utilisation systématique indispensable des standards de calibration GMP, Paris, Février 2004

44 Quantification : DNC vs. LSC
GMP, Paris, Février 2004

45 Quantification : QWBAL vs. DNC
GMP, Paris, Février 2004

46 Interprétation des résultats
vue d‘ensemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps distribution régionale dans les tissus et structures contrôle visuel de l‘absence de contamination archivage permettant une re-lecture/contre-expertise analyses complémentaires possibles GMP, Paris, Février 2004

47 Interprétation des résultats
macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!) radioactivité totale, pas une structure chimique donnée pharmacocinétique! importance des conditions expérimentales purité radiochimique de la substance testée LOD, LOQ doses nominales, doses radioactives métabolites volatiles, 3H20 „ouvrir les yeux, voir large“ GMP, Paris, Février 2004

48 Principales applications
contribution à la sélection de molécules (PD,Tox) contribution à la sélection de formulations (Galénique) études ADME (PK) safety assessment (ex: passage transplacentaire) (Tox) estimation de la radio-exposition (hADME) dossiers d‘enregistrement études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine, résidus, „mottled pattern“ etc) GMP, Paris, Février 2004

49 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

50 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

51 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

52 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

53 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

54 Exemples d’application
GMP, Paris, Février 2004

55 Conclusions informations spécifiques, importantes
nombreuses applications en recherche & développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc) difficultés techniques expertise nécessaire coût élevé des équipements  radioactivité totale, macroscopie, animal GMP, Paris, Février 2004

56 H.Harlemann, G.Gross, O.Kretz A.Wach, P.Schnider
Remerciements H.Harlemann, G.Gross, O.Kretz A.Wach, P.Schnider GMP, Paris, Février 2004

57 Merci pour votre attention !
GMP, Paris, Février 2004