TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

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1 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE
Lundi 1 octobre 2007 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

2 Moyens de communication de la cellule avec l'environnement
Lundi 1 octobre 2007 Moyens de communication de la cellule avec l'environnement Procaryotes Tout passe par la membrane plasmique Eucaryotes Endocytose milieu extra cellulaire  lysosomes  digestion  métabolites dans le cytosol Exocytose : voie sécrétoire synthèse de nouvelles molécules  compartiments  surface

3 Fig 13-1 Les voies endocytaire et sécrétoire voie endocytaire
voie sécrétoire voies de retour Fig 13-1

4 La lumière Espace compris à l'intérieur d'un compartiment limité par une membrane Topologiquement toutes équivalentes entre elles et avec l'espace extra cellulaire

5 Rôle de la voie endo/exo-cytaire
Modification des molécules qui seront sécrétées vers l'extérieur Connections (indirecte) de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique

6 Topologie des membranes
Les lumières sont équivalentes Le transport se fait par vésicules

7 Le cargo Molécule luminale ou membranaire qui est transportée par la vésicule

8 Fig 13-2 Transport vésiculaire maintien de l'asymétrie de la membrane
pas de membrane à traverser pour les molécules solubles Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-2 Fusion des feuillets bleus Fusion des feuillets rouges

9 Fig 13-3 Recirculation Voie endocytaire Voie sécrétrice
Golgi  RE Endos tardif  Golgi Endos précoce  membrane Fig 13-3 Voie sécrétrice Compartiments intracellulaires impliqués dans les voies endo/exo-cytaires

10 Équilibre entre les compartiments
Entrées = sorties Pour les membranes et pour les cargos  Un aller  un retour Sélectivité Des cargos transportés Des destinations

11 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE
Les mécanismes moléculaires du transport par membrane et le maintien de la diversité des compartiments Transport à partir du réticulum endoplasmique à travers le Golgi Transport du TGN vers les lysosomes Transport de la membrane plasmique vers l'intérieur de la cellule : endocytose Transport du TGN vers l'extérieur de la cellule : exocytose

12 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE
Lundi 1 octobre 2007 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE I - Les mécanismes moléculaires du transport membranaire et le maintien de la diversité des compartiments Phénomènes de bourgeonnement et fusion Maintien des différences entre les compartiments p712

13 Problème Échange permanent entre les compartiments  mélange des molécules  tous les compartiments finiront pas être identiques

14 La solution Marqueurs moléculaires exprimés à la surface cytosolique des membranes

15 Méthodes d'approche Systèmes sans cellules
Protéines de fusion avec la GFP Génétique

16 Systèmes sans cellules
Population donneuse cellules mutantes qui n'ont pas N-acétylglucosamine transférase I infectées par un virus (donc glycoprotéine virale présente) pas de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine Golgi accepteur possède N-acétylglucosamine transférase I (type sauvage) non infecté par le virus donc pas de glycoprotéine virale Mélange des deux présence de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine  Il a fallu qu'il y ait transport

17 Protéines de fusion avec la GFP

18 Génétique Protéines thermosensibles codées par des mutants
Phénomène de suppression multicopies

19 Éléments d'approche Les types de vésicules
Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion

20 Éléments d'approche Les types de vésicules
Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion

21 1 - Les types de vésicules
Vésicules recouvertes sur leur face cytosolique Bourgeonnement Perte du manteau Fusion des membranes

22 Les deux rôles du manteau
Concentration de protéines membranaires dans un patch qui formera la vésicule  permet la sélection des molécules à transporter Moule la vésicule qui aura ainsi toujours à peu près la même taille

23 Les trois types de manteau des vésicules recouvertes
Clathrine COPI COPII

24 Fig 13-4 Les trois types de manteau des vésicules recouvertes
Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-4

25 Utilisation des différents manteaux dans le trafic vésiculaire
Clathrine : à partir du Golgi et à partir de la membrane plasmique au moins trois types de vésicules à clathrine COPI et COPII : à partir du RE et du Golgi Beaucoup d'autres

26 Lundi 1 octobre 2007 Utilisation des différents manteaux dans le traffic vésiculaire Fig 13-5 p713

27 Éléments d'approche Les types de vésicules
Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion

28 2 - Assemblage du manteau
Lundi 1 octobre 2007 2 - Assemblage du manteau a - Exemple : clathrine Le plus étudié (b - COPI et COPII) p716

29 Lundi 1 octobre 2007 Puits et vésicules recouverts de clathrine en congélation sublimation rapide Fig 13-6

30 Clathrine Une sous-unité de clathrine = Une sous-unité = un triskélion
3 grosses chaînes + 3 petites chaînes Une sous-unité = un triskélion Assemblage des triskélions en un panier d'hexagones et pentagones Triskélions peuvent s'assembler spontanément en panier même sans membrane

31 Fig 13-7 Manteau de clathrine (C) Cryo-électro-microphotographie
Lundi 1 octobre 2007 Manteau de clathrine (C) Cryo-électro-microphotographie (B) Deux triskélions chaînes lourdes en gris ou rouge chaînes légères en jaune (A) Ombrage au platine Fig 13-7

32 Manteau de clathrine Un manteau = 36 triskélions (sans la vésicule)
12 pentagones + 6 hexagones Formation de deux coquilles externe interne : domaines N-terminaux des chaînes lourdes où se fixent les adaptines Sur une vésicle : 12 pentagones + beaucoup plus d'hexagones

33 Adaptine Protéine de manteau à clathrine Complexe multiprotéique
Lie la clathrine à la membrane Piège les protéines transmembranaires dont les récepteurs qui capturent les cargos solubles Au moins 4 types d'adaptine pour les différents récepteurs de cargo

34 Fig 13-8 Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine
Lundi 1 octobre 2007 Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine Les adaptines se lient à la clathrine et au complexe cargo/cargo-r Dynamine = GTPase Fig 13-8

35 Pincement de la membrane
Dynamine + autres protéines Fusion des feuillets non cytosoliques (grâce à la dynamine)

36 Fig 13-9 Rôle de la dynamine
Lundi 1 octobre 2007 Rôle de la dynamine Puits à clathrine dans les cellules nerveuses de drosophiles shibire ayant une mutation du gène de la dynamine entraînant une paralysie. Anneau correspondant à la dynamine mutée Fig 13-9

37 Perte du manteau La vésicule quitte la membrane
Lundi 1 octobre 2007 Perte du manteau La vésicule quitte la membrane Le manteau de clathrine est perdu immédiatement intervention de chaperonne de la famille des hsp70 (ATPase) auxilline active l'ATPase La vésicule doit attendre d'être constituée pour que le manteau se retire p718

38 Spécificité du manteau
Mécanismes généraux identiques Mais chaque membrane a ses spécificités membrane plasmique (riche en cholestérol) : nécessité de beaucoup d'énergie autres membranes : existence de bourgeonnements

39 b - Protéines autres que la clathrine
CopI : 7 sous-unités protéiques analogies avec adaptine Bourgeonnement à partir du Golgi CopII : 4 sous-unités protéiques Bourgeonnement à partir du RE (a – Clathrine)

40 Toutes les vésicules ne sont pas sphériques
Lundi 1 octobre 2007 Toutes les vésicules ne sont pas sphériques Membranes contenant des protéines fluorescentes Long tubules qui émanent de endosomes et réseau trans-golgien (TGN) Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume) "une vésicule peut être tubulaire !" #4 p718

41 c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTPases monomériques, rappel
Lundi 1 octobre 2007 p719

42 Lundi 1 octobre 2007 c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel) GTP binding proteins 2 états Actif avec liaison de GTP Inactif avec liaison de GDP 2 types Monomérique (= GTPases monomériques) les mieux connues Trimérique (= GTPases trimériques = protéines G) Passage d'un état à l'autre par GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP  GTP GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP  GDP #5p719

43 GTPase monomérique recruteuse de manteau
Lundi 1 octobre 2007 Formation d'une vésicule à COPII (RE) GTPase monomérique recruteuse de manteau Fig 13-10 Sar 1-GTP recrute COPII vers la membrane = Sec12

44 GTP binding proteins (Rappel)
Monomérique GTPases GTPases de recrutement du manteau Protéines ARF (ADP Ribosylation Factor) Assemblage COPI et clathrine au Golgi Protéine Sar 1 Assemblage COPII au réticulum endoplasmique ? Assemblage clathrine à la membrane plasmique Rab : amarrage des protéines de transport Etc… Trimériques Protéines G

45 Protéines de formation des vésicules recouvertes de COP I- et COP II
Lundi 1 octobre 2007 Protéines de formation des vésicules recouvertes de COP I- et COP II Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway Review Sylvie Urbé, Sharon A. Tooze and Francis A. Barr Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research Volume 1358, Issue 1 , 21 August 1997, Pages 6-22 Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway Review Sylvie Urbé, Sharon A. Tooze and Francis A. Barr Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research Volume 1358, Issue 1 , 21 August 1997, Pages 6-22 COP I- and COP II-coated vesicle formation proteins

46 GTPases de recrutement du manteau : les acteurs
Lundi 1 octobre 2007 GTPases de recrutement du manteau : les acteurs Membrane du RE Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor) p720

47 GTPases de recrutement du manteau : la séquence
Lundi 1 octobre 2007 GTPases de recrutement du manteau : la séquence Une vésicule à COPII est sur le point de bourgeonner (du RE) Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE appelée Sec 12) se lie à la Sar 1 du cytosol et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras lui permettant de se fixer dans la membrane du RE puis recrute des sous-unités de COPII La membrane bourgeonne en incluant des protéines membranaires sélectionnées p720

48 Fig 13-10 Formation d'une vésicule à COPII Seule diapo à retenir
Lundi 1 octobre 2007 Formation d'une vésicule à COPII Fig 13-10 Seule diapo à retenir

49 Désassemblage du manteau
Lundi 1 octobre 2007 Désassemblage du manteau GTPases de recrutement du manteau Hydrolyse du GTP en GDP La queue est exclue de la membrane  désassemblage du manteau C'est le temps qui finit par déclencher l'hydrolyse p720

50 Éléments d'approche Les types de vésicules
Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion

51 Lundi 1 octobre 2007 3 - Guidage du transport Reconnaissance vésicule de transport  membrane cible Toutes les vésicules de transport ont des marqueurs de surface spécifiques de leur origine et de leur cargo Les membranes cible ont des récepteurs complémentaires #6 p720

52 Reconnaissance vésicule de transport  membrane cible
SNAREs Spécificité Catalyseur de la fusion Rabs (GTPases cible) Amarrage initial Fixation de la vésicule En collaboration avec d'autres protéines

53 rab GTP-Binding Proteins
A large family of MONOMERIC GTP-BINDING PROTEINS that play a key role in cellular secretory and endocytic pathways

54 Abréviations SNAREs : SNAP receptors
SNAPs : soluble NSF attachment proteins NSF : N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein

55 Fig 13-11 Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de transport
Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-11

56 SNAREs Au moins 20 espèces différentes Protéines trans-membranaires
Marchent par deux : v- SNAREs (vesicle) t- SNAREs (target = cible) Domaine hélicoïdal qui s'enroule l'un dans l'autre  complexe trans–SNARE qui contribue à la fusion des membranes

57 Complexe trans–SNARE Toujours 4 hélices  Ici 3 protéines
Lundi 1 octobre 2007 Toujours 4 hélices  3 formées par t-SNARE 1 formée par v-SNARE Ici 3 protéines v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine) t-SNARE 1 hélice (syntaxine) t-SNARE 2 hélices (Snap25 : protéine périphérique) Sutton RB, Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 angstrom resolution. Nature 1998; 395(6700) The evolutionarily conserved SNARE proteins and their complexes are involved in the fusion of vesicles with their target membranes; however, the overall organization and structural details of these complexes are unknown. Here we report the X-ray crystal structure at 2.4 Angstrom resolution of a core synaptic fusion complex containing syntaxin-1A, synaptobrevin-II and SNAP-25B. The structure reveals a highly twisted and parallel four-helix bundle that differs from the bundles described for the haemagglutinin and HIV/SIV gp41 membrane-fusion proteins. Conserved leucine-zipper-like layers are found at the centre of the synaptic fusion complex. Embedded within these leucine-ripper layers is an ionic layer consisting of an arginine and three glutamine residues contributed from each of the four alpha-helices. These residues are highly conserved across the entire SNARE family. The regions flanking the leucine-zipper-like layers contain a hydrophobic core similar to that of more general four-helix-bundle proteins. The surface of the synaptic fusion complex is highly grooved and possesses distinct hydrophilic, hydrophobic and charged regions. These characteristics may be important for membrane fusion and for the binding of regulatory factors affecting neurotransmission.

58 Fig 13-12 Structure de SNAREs appariés dans les terminaisons nerveuses
Lundi 1 octobre 2007 Structure de SNAREs appariés dans les terminaisons nerveuses Fig 13-12 Sutton RB, Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 angstrom resolution. Nature 1998; 395(6700) The evolutionarily conserved SNARE proteins and their complexes are involved in the fusion of vesicles with their target membranes; however, the overall organization and structural details of these complexes are unknown. Here we report the X-ray crystal structure at 2.4 Angstrom resolution of a core synaptic fusion complex containing syntaxin-1A, synaptobrevin-II and SNAP-25B. The structure reveals a highly twisted and parallel four-helix bundle that differs from the bundles described for the haemagglutinin and HIV/SIV gp41 membrane-fusion proteins. Conserved leucine-zipper-like layers are found at the centre of the synaptic fusion complex. Embedded within these leucine-ripper layers is an ionic layer consisting of an arginine and three glutamine residues contributed from each of the four alpha-helices. These residues are highly conserved across the entire SNARE family. The regions flanking the leucine-zipper-like layers contain a hydrophobic core similar to that of more general four-helix-bundle proteins. The surface of the synaptic fusion complex is highly grooved and possesses distinct hydrophilic, hydrophobic and charged regions. These characteristics may be important for membrane fusion and for the binding of regulatory factors affecting neurotransmission.

59 SNAREs nerveuses Cibles de neurotoxines
Lundi 1 octobre 2007 SNAREs nerveuses Cibles de neurotoxines Tétanos Botulisme Protéases qui entrent dans des neurones spécifiques, clivent les SNAREs et bloquent la transmission synaptique #6 p722

60 Désassemblage du complexe trans-SNARE
Lundi 1 octobre 2007 Désassemblage du complexe trans-SNARE Après fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane Doit être désassemblé  NSF (N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein) #7 p722

61 NSF Cycle entre les membranes et le cytosol Catalyse le désassemblage
ATPase Ressemble à une chaperone cytosolique qui solubilise et aide à replier correctement les protéines dénaturées Déroule les hélices des SNAREs en collaboration avec des protéines adaptatrices

62 Lundi 1 octobre 2007 Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion terminé NSF + des protéines adaptatrices  hydolyse ATP +séparation des SNAREs La dissociation régule quand et où les membranes vont fusionner Fig 13-13 #7 p722

63 Éléments d'approche Les types de vésicules
Lundi 1 octobre 2007 Éléments d'approche Les types de vésicules Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion #8 p722

64 Lundi 1 octobre 2007 4 – Amarrage Rôle important des protéines Rab dans la spécificité du transport vésiculaire #8 p722

65 Protéines Rab GTPases monomériques
Plus de 30 membres  la plus grande sous-famille de GTPases monomériques Distribution caractéristique sur les membranes cellulaires Chaque organite a au moins une protéine Rab sur sa face cytosolique Facilitent et régulent Le taux d'amarrage des vésicules et l'appariement des v- t- SNAREs

66 Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab
Table 13-1

67 Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab
RE et Golgi Rab2 cis Golgi network Rab3A vésicules synaptiques, granules sécrétoires Rab4 endosomes pécoces Rab5A membrane plasmique, vésicules à manteau de clathrine Rab5C early endosomes tardifs Rab6 citernes médianes et du trans Golgi Rab7 endosomes tardifs Rab8 vésicules sécrétoires (basolateral) Rab9 endosomes tardifs, trans Golgi network Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab

68 Protéines Rab Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 états : Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol Actif avec liaison de GTP associé à une membrane

69 [c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel)
GTP binding proteins : 2 états Actif avec liaison de GTP Inactif avec liaison de GDP Passage d'un état à l'autre par (GEFs): GDPGTP (monomérique = GTPase ) GTPase-Activating Proteins (GAPs) : GTPGDP (trimérique = protéines G) Guanine-nucleotide-Exchange Factors]

70 Rôle des protéines Rab dans l'amarrage des protéines de transport
Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-14 Sar1COPIIformation de la vésicule RabSNARE amarrage de la vésicule #8 p723

71 Les effecteurs de Rab (1/2)
Reconnaissance de Rab (Lié, GTP) par un Rab effecteur Gros complexe protéique Très variable d'une protéine Rab à une autre

72 Les effecteurs de Rab (2/2)
Parfois longues protéines filamenteuses qui limitent le mouvement des vésicules entre des citernes golgiennes adjacentes Se lient à Rab et empêchent l'hydrolyse prématurée du GTP D'autres sont des moteurs qui dirigent les vésicules vers leur destination

73 Protéines Rab Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs
Lundi 1 octobre 2007 Protéines Rab Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs Accélèrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles Achèvent le verrouillage de la vésicule à sa cible par appariement des SNAREs  prêt pour la fusion Après la fusion, la protéine Rab hydrolyse son GTP lié et retourne dans le cytosol #8 p724

74 Éléments d'approche Les types de vésicules
Lundi 1 octobre 2007 Éléments d'approche Les types de vésicules Assemblage du manteau (les GTPases) Guidage du transport (les SNARE) Amarrage (protéines Rab) Fusion #9 p724

75 5 – Fusion Distinguer amarrage de fusion
Lundi 1 octobre 2007 5 – Fusion Distinguer amarrage de fusion Fusion ne fait pas toujours suite à amarrage : eg : exocytose régulée Amarrage : les protéines des membranes interagissent et adhèrent Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre  nécessité d'extrusion d'eau  protéines de fusion pour résoudre le problème énergétique ( dynamine au cours du bourgeonnement des vésicules à clathrine) #9 p724

76 Modèle de concentration des protéines SNAREs au cours de la fusion de membrane
Des liposomes (in vitro) v-SNAREs + des liposomes t-SNAREs  fusion lente  Intervention (dans la cellule) d'autres protéines pour initier la fusion ou pour retirer des protéines inhibitrices Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-15 #9 p724

77 Importance des phénomènes de fusion de membrane
Lundi 1 octobre 2007 Importance des phénomènes de fusion de membrane Transport vésiculaire Fécondation (fusion oolemme spermatozoïde) Fusion des myoblastes Maintien de l'identité des cellules Maintien de l'identité des compartiments intra-cellulaires Mode d'entrée des virus à enveloppe dans les cellules #10 p724

78 Analogie protéines de fusion virales  SNAREs
Lundi 1 octobre 2007 Analogie protéines de fusion virales  SNAREs Human Immunodeficiency Virus (HIV) Se lie aux récepteurs de la surface de la cellule Les membranes de la cellule et du virus fusionnent L'acide nucléique viral entre dans la cellule et s'y réplique Virus influenza Entrée du virus dans la cellule par endocytose Arrivée dans l'endosome Activation d'une protéine de fusion de l'enveloppe virale Fusion de la membrane virale et de la membrane endosomale L'acide nucléique viral entre dans le cytosol et s'y réplique #10 p724

79 Fig 13-16 Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule #10 p724
Lundi 1 octobre 2007 Fig 13-16 #10 p724

80 Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule
Liaison de HIV à la protéine CD4 à la surface des lymphocytes… …par l’intermédiaire de la protéine virale gp120 liée à la protéine de fusion de HIV Une 2ème protéine de surface de la cellule hôte qui sert normalement de récepteur aux chimiokines agit avec gp120  Séparation de gp120 et de la protéine de fusion  Enfouissement de la partie hydrophobe de la protéine de fusion dans la membrane La protéine de fusion (trimère) se comporte transitoirement comme une protéine de membrane dans deux membrane opposées  Réarrangement spontané de la protéine de fusion qui se collabe en une structure compacte de 6 hélices  Libération d’énergie  rapprochement des membranes

81 Résumé Les manteaux GTPases (Sar1 et ARF) GTPases (Rab) SNAREs

82 Lundi 1 octobre 2007

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