L’amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR)

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1 L’amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR)
Technique de biologie moléculaire (1985) Avant ? Isoler la séquence Clonage Amplification dans une cellule hôte Purification Méthode lourde et longue

2 PCR Technique de réplication ciblée in vitro
Page 16 Technique de réplication ciblée in vitro Elle permet d’obtenir à partir d’un échantillon peu abondant ou impure, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN. Ordre de grandeur: milliards de copies en quelques heures

3 PCR (principe) Page 16

4 PCR Page 17 Principe Réaliser une succession de réplication d’un fragment d’ADN double brin (ADN polymérase – amorce) Où? Dans un tube lui-même placé dans un appareil programmable = thermocycleur

5 PCR Le thermocycleur Placer le tube aux températures voulues pendant des durées programmées (cycles). Un cycle reproduit 3 températures différentes pendant des durées différentes. Durée d’un cycle = 2-3 minutes environ.

6 PCR Les acteurs: ADN à amplifier
Pages 17-18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

7 Présents en excès par rapport à l’ADN
PCR Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4) Présents en excès par rapport à l’ADN

8 PCR Les acteurs: ADN à amplifier
Page 17 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

9 PCR Page 17 ADN à amplifier:

10 PCR

11 PCR Les acteurs: ADN à amplifier
Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

12 PCR 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques
Page 18 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Petits brins d’ADN ~ 20 bases

13 PCR 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Rôles ?
Page 18 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Rôles ? Délimiter la région d’ADN à amplifier Extrémités 3’ libre servent d’amorce pour l’ADN polymérase Il faut connaître les séquences nucléotidiques des extrémités

14 PCR Les acteurs: ADN à amplifier
Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

15 PCR ADN polymérase = Taq Polymérase (Taq Pol)
Page 18 ADN polymérase = Taq Polymérase (Taq Pol) ADN polymérase thermorésistante (Thermus aquaticus) Température optimale d’action = 72°C (95°C)

16 PCR ADN polymérase Fonctionnement: Lecture du brin matrice 3’ → 5’
Page 18 ADN polymérase Fonctionnement: Lecture du brin matrice 3’ → 5’ Synthèse du nouveau brin complémentaire 5’ → 3’

17 PCR 3’ 5’ 3’ 5’

18 PCR Les acteurs: ADN à amplifier
Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

19 PCR Désoxyribonucléotides (4) 4 sortes: - A = adénine - T = thymine
- G = guanine - C = cytosine

20 PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

21 PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

22 PCR

23 PCR Page 18 Dénaturation: Le tube est chauffé qq secondes à 94°C

24 PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

25 PCR Hybridation (durée = 1 minute): ↓ T°C rapidement à 55°C (40-65°C)
Page 18 Hybridation (durée = 1 minute): ↓ T°C rapidement à 55°C (40-65°C) Les amorces « reconnaissent » leur séquence complémentaire sur les brins cibles ou matrices. Hybridation (= fixation)

26 PCR Page 18

27 PCR Page 19 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

28 PCR Elongation (durée = 1 minute): ↑ T°C à 72°C
Page 19 Elongation (durée = 1 minute): ↑ T°C à 72°C La Taq Polymérase ajoute des désoxynucléotides aux amorces hybridées (5’→ 3’) en lisant le brin matrice dans le sens inverse (3’ → 5’)

29 PCR Page 19

30 PCR Page 20 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

31 PCR 1er cycle: Synthèse de brins complémentaires
Page 19 1er cycle: Synthèse de brins complémentaires Plus court que le brin matrice Plus long que la séquence souhaitée

32 PCR Page 19 1er cycle:

33 PCR Page 19 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

34 PCR 2ème cycle: Synthèse de brins complémentaires
Page 19 2ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Apparition des premiers brins avec la longueur souhaitée

35 PCR Page 19 2ème cycle:

36 PCR Page 20 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

37 PCR 3ème cycle: Synthèse de brins complémentaires
Page 19 3ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Apparition des premiers amplicons Amplicons = ADN double-brins bornés par les amorces = fragments d’ADN recherché.

38 PCR Comment peut-on déterminer le nombre d’amplicons obtenu après un certain nombre de cycles? Nbre d’amplicons = 2n – 2n (n = nbre de cycles) = nombre de copies d’ADN = nombre de copies longues

39 PCR Réaction enzymatique complexe
Amplification exponentielle tant que l’ADN matrice est le seul facteur limitant

40 PCR Durant la réaction: limite le nombre de copies à 105 - 106
↓ quantité d’amorces et de dNTP ↑ nombre de copies d’ADN → ↑ viscosité du milieu → ↓ vitesse réactionnelle Synthèse d’ADN → libération d’ions phosphate → inhibition de la Taq polymérase. limite le nombre de copies à

41 PCR A la fin: Séparer les fragments d’ADN amplifiés → amplicons
Electrophorèse (gel d’agarose) Comment ?

42 PCR Ses applications (très nombreuses):
Page 20 Ses applications (très nombreuses): But principal = rendre décelable, et de ce fait analysable, de l’ADN, souvent présent à l’état de traces. La recherche d’une pathologie Le diagnostic anténatal ou prénatal La recherche de personnes (criminalistique)